A screen for deficiencies in GPI-anchorage of wall glycoproteins in yeast.
A screen for deficiencies in GPI-anchorage of wall glycoproteins in yeast.
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DOI：
10.1002/yea.1797
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发表时间：
2010-08
期刊：
影响因子：
2.6
通讯作者：
Lipke, Peter N.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gonzalez, Marlyn;Goddard, Noel;Hicks, Charles;Ovalle, Rafael;Rauceo, Jason M.;Jue, Chong K.;Lipke, Peter N.
许多对酵母细胞壁的组装和生物发生至关重要的基因和酶仍未被识别或特征很少。因此，我们基于分泌的 GFP-Sag1p 融合蛋白的定量，设计了一种高通量基因组筛选方法，用于检测 GPI 细胞壁蛋白 (GPI-CWP) 锚定缺陷。用在 GPD 启动子下表达融合蛋白的质粒转化酿酒酵母二倍体缺失菌株，然后在指数中期生长后测定培养物上清液中的 GFP 荧光。在山梨糖醇存在的情况下，在缓冲的确定成分培养基中于 18°C 生长，可以减少分泌到培养基中的荧光标记物量的变异性。二次筛选包括 GFP 免疫印迹、荧光发射光谱、细胞表面荧光和细胞完整性。在因影响细胞壁生物合成或结构的基因而删除的 167 个突变体中，有 8 个突变体相对于亲本菌株 BY4743 表现出一致的 GFP 过度分泌：tdh3（3-磷酸甘油脱氢酶）、gda1（鸟苷二磷酸酶）、gpi13 和 mcd4（均为乙醇胺磷酸-GPI 转移酶）、kre5 和 kre1（参与 β1,6 的合成）葡聚糖）、dcw1（参与 GPI-CWP 与细胞壁葡聚糖的交联）和 cwp1（一种主要细胞壁蛋白）。此外，一些基因的缺失导致GFP分泌减少。这些结果阐明了特定基因在细胞壁生物发生中的特定作用，包括旁系同源基因的分化。
Many of the genes and enzymes critical for assembly and biogenesis of yeast cell walls remain unidentified or poorly characterized. Therefore, we designed a high throughput genomic screen for defects in anchoring of GPI-cell wall proteins (GPI-CWPs), based on quantification of a secreted GFP-Sag1p fusion protein. Saccharomyces cerevisiae diploid deletion strains were transformed with a plasmid expressing the fusion protein under a GPD promoter, then GFP fluorescence was determined in culture supernatants after mid-exponential growth. Variability in the amount of fluorescent marker secreted into the medium was reduced by growth at 18°C in buffered defined medium in the presence of sorbitol. Secondary screens included immunoblotting for GFP, fluorescence emission spectra, cell surface fluorescence, and cell integrity. Of 167 mutants deleted for genes affecting cell wall biogenesis or structure, eight showed consistent hyper-secretion of GFP relative to parental strain BY4743: tdh3 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), gda1 (guanosine diphosphatase), gpi13 and mcd4 (both ethanolamine phosphate-GPI-transferases), kre5 and kre1 (involved in synthesis of β1,6 glucan), dcw1(implicated in GPI-CWP cross-linking to cell wall glucan), and cwp1 (a major cell wall protein). In addition, deletion of a number of genes caused decreased secretion of GFP. These results elucidate specific roles for specific genes in cell wall biogenesis, including differentiating among paralogous genes.
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影响因子：
2.6
作者：
Delgado, ML;Gil, ML;Gozalbo, D
通讯作者：
Gozalbo, D
影响因子：
--
作者：
de Groot, P W;Ruiz, C;Vazquez de Aldana, C R;Duenas, E;Cid, V J;Del Rey, F;Rodriquez-Pena, J M;Perez, P;Andel, A;Caubin, J;Arroyo, J;Garcia, J C;Gil, C;Molina, M;Garcia, L J;Nombela, C;Klis, F M
通讯作者：
Klis, F M
影响因子：
1.8
作者：
Donalies, Ute E. B.;Nguyen, Huyen T. T.;Nevoigt, Elke
通讯作者：
Nevoigt, Elke
影响因子：
3.2
作者：
GilNavarro, I;Gil, ML;Gozalbo, D
通讯作者：
Gozalbo, D
DOI：
10.1083/jcb.122.2.307
发表时间：
1993-07
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Abeijon C;Yanagisawa K;Mandon EC;Häusler A;Moremen K;Hirschberg CB;Robbins PW
通讯作者：
Robbins PW