小鼠炎症创面组织匀浆体外模拟创面炎症微环境的可行性研究
小鼠炎症创面组织匀浆体外模拟创面炎症微环境的可行性研究
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DOI：
10.3760/cma.j.cn501120-20200720-00351
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发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
王达利
中科院分区：
文献类型：
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作者：
郝艺;杨沁馨;王旗;徐广超;祁放;邓呈亮;魏在荣;王达利
目的探讨小鼠炎症创面组织匀浆体外模拟创面炎症微环境的可行性。方法(1)取10只8周龄C57BL/6雄性小鼠,在背部中线两侧用打孔器各取直径1.0 cm的圆形全层皮肤组织,制作正常皮肤组织匀浆上清液。形成全层皮肤缺损创面48 h后,取距创缘2 mm内创面组织,制作炎症创面组织匀浆上清液。取2种组织匀浆上清液,调整总蛋白质量浓度为1 mg/mL,酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,样本数为6。(2)取原代人脐带间充质干细胞(hUCMSC)并培养至第3代,培养48 h后提取正常外泌体。另外取第3代hUCMSC,分别加入总蛋白质量浓度为30、50、100 µg/mL正常皮肤组织匀浆上清液和炎症创面组织匀浆上清液,培养48 h后,提取30、50、100 µg/mL正常蛋白刺激外泌体和30、50、100 µg/mL炎症蛋白刺激外泌体。取正常外泌体、30 µg/mL正常蛋白刺激外泌体和30 µg/mL炎症蛋白刺激外泌体,透射电子显微镜下观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径,蛋白质印迹法检测CD9和CD63表达。(3)取1 d龄C57BL/6小鼠乳鼠20只,分离培养原代成纤维细胞(Fb)和第3代Fb,倒置相差显微镜下观察细胞形态。取第3代Fb,培养2 h,利用细胞爬片法结合免疫荧光法观察波形蛋白的表达。(4)取第3代Fb,按随机数字表法分为对照组,正常外泌体组,30、50、100 µg/mL正常蛋白刺激外泌体组及30、50、100 µg/mL炎症蛋白刺激外泌体组,每组4孔。对照组不进行任何处理,其余7组依次加入实验(2)中制备的正常外泌体,30、50、100 µg/mL正常蛋白刺激外泌体和30、50、100 µg/mL炎症蛋白刺激外泌体,并调整外泌体终质量浓度为10 µg/mL。培养48 h,采用细胞计数试剂盒8法检测8组细胞活力。(5)取2个批次第3代Fb,同实验(4)进行分组及处理,每组4孔,并分别调整外泌体终质量浓度为1、10 µg/mL,采用细胞划痕试验检测培养6、12、24 h细胞迁移率。(6)取2个批次第3代Fb,同实验(4)进行分组及处理,但不设置对照组,每组3孔,并调整外泌体终质量浓度为1、10 µg/mL,实时荧光定量反转录PCR法检测培养48 h转化生长因子β1(TGF-β_1)、TGF-β_3、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Bonferroni法。结果(1)伤后48 h,小鼠炎症创面组织匀浆上清液中TNF-α含量为(116±3)pg/mL,显著高于正常皮肤组织匀浆上清液的(97 ± 5)pg/mL, t =3.306, P 0.05)。外泌体终质量浓度为10 µg/mL时,培养48 h,7组细胞TGF-β_1、α-SMA mRNA表达量组间总体比较,差异无统计学意义(F =1.487、1.308, P >0.05)。50 µg/mL炎症蛋白刺激外泌体组细胞培养48 h TGF-β_3 mRNA表达量明显高于正常外泌体组、50 µg/mL正常蛋白刺激外泌体组及30、100 µg/mL炎症蛋白刺激外泌体组(<0.05)。结论小鼠炎症创面组织匀浆上清液预处理对hUCMSC外泌体的总蛋白含量无影响,低浓度炎症创面组织匀浆上清液刺激所得的hUCMSC外泌体能够上调Fb的增殖和迁移能力,但炎症创面组织匀浆上清液中的炎症介质含量过低,不足以有效启动间充质干细胞抗炎及组织修复旁分泌效应。