Construction and application of an inducible system for homogenous expression levels in bulk cell lines.
Construction and application of an inducible system for homogenous expression levels in bulk cell lines.
复制标题
DOI：
10.1371/journal.pone.0006445
复制
发表时间：
2009-07-30
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Müller-Tidow C
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Yu J;Müller H;Hehn S;Koschmieder S;Schönig K;Berdel WE;Serve H;Müller-Tidow C
严格控制的条件表达系统对于基因的功能表征至关重要。目前，筛选多个克隆以鉴定严格控制的克隆是必要的，但耗时。在这里，我们描述了一个系统融合泰特（四环素）诱导元件，BAC（细菌人工染色体）和网关技术在一起，使BAC转染的真核细胞培养物中的基因表达的严格控制。将内切酶克隆到穿梭载体和BAC中有助于载体构建。EGFP（增强型绿色荧光蛋白）允许FACS（荧光激活细胞分选），BAC技术确保严格控制不依赖于整合位点的基因表达。在目前的第一个应用中，我们的目的基因编码β-连环蛋白-ER α融合蛋白。经荧光素酶检测和Western blotting检测，BAC E11-IGR-β-catenin-ERα载体在HTB 56肺癌细胞中对泰特或多西环素（Dox）具有敏感的诱导作用，且呈剂量依赖性，背景值较低。这是一种高效的工具，用于在细胞系中快速生成严格控制的Tet-inducible系统。
Stringently controlled conditional expressing systems are crucial for the functional characterization of genes. Currently, screening of multiple clones to identify the tightly controlled ones is necessary but time-consuming. Here, we describe a system fusing Tet (tetracycline)-inducible elements, BAC (bacterial artificial chromosome) and Gateway technology together to allow tight control of gene expression in BAC-transfected eukaryotic bulk cell cultures. Recombinase cloning into the shuttle vector and the BAC facilitates vector construction. An EGFP (enhanced green fluorescent protein) allows FACS (fluorescence activated cell sorting) and the BAC technology ensures tight control of gene expression that is independent of the integrating site. In the current first application, our gene of interest encodes a β-catenin-ERα fusion protein. Tested by luciferase assay and western blotting, in HTB56 lung cancer cells the final BAC E11-IGR-β-catenin-ERα vector demonstrated sensitive inducibility by Tet or Dox (doxycycline) in a dose-dependent manner with low background, and the EGFP was an effective selection marker by FACS in bulk culture HTB56 and myeloblastic 32D cells. This is a highly efficient tool for the rapid generation of stringently controlled Tet-inducible systems in cell lines.
登录
查看更多内容
DOI：
10.1073/pnas.0409861102
发表时间：
2005-02-15
影响因子：
11.1
作者：
Kittler, R;Pelletier, L;Buchholz, F
通讯作者：
Buchholz, F
影响因子：
5.1
作者：
Koponen, JK;Kankkonen, H;Ylä-Herttuala, S
通讯作者：
Ylä-Herttuala, S
DOI：
10.1073/pnas.130192197
发表时间：
2000-07-05
影响因子：
11.1
作者：
Urlinger, S;Baron, U;Hillen, W
通讯作者：
Hillen, W
影响因子：
5.3
作者：
Ebert, AD;Chen, F;Bohn, MC
通讯作者：
Bohn, MC
影响因子：
2.9
作者：
Hong, YK;Kim, DH;Strauss, WM
通讯作者：
Strauss, WM