Site-specific dual-color labeling of long RNAs for single-molecule spectroscopy.
Site-specific dual-color labeling of long RNAs for single-molecule spectroscopy.
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DOI：
10.1093/nar/gkx1100
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发表时间：
2018-02-16
影响因子：
14.9
通讯作者：
Freisinger E
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Zhao M;Steffen FD;Börner R;Schaffer MF;Sigel RKO;Freisinger E
以位点特异性但普遍适用的方式标记长 RNA 分子是许多光谱应用不可或缺的一部分。在这里，我们提出了一种新颖的共价标记方法，该方法具有位点特异性，并且可扩展到长而复杂的折叠 RNA。在这种方法中，定制设计的 DNA 链与 RNA 杂交，引导反应基团靶向预选的腺嘌呤残基。随后，功能化的核苷酸以及同时氧化的 3' 末端可以通过生物正交化学与两个不同的荧光团缀合。我们使用 275 个核苷酸的调节 RNA（大肠杆菌的 btuB 核糖开关）验证了该模块化标记平台，通过修饰双链体内的碱基证明了其普遍适用性，并显示了其针对一对相邻腺嘌呤的位点选择性。通过使用 FRET 作为传感器，可视化和表征核糖开关在其辅因子腺苷钴胺素结合后的构象平衡，从而在单分子水平上确认 RNA 的天然折叠和功能。所提出的标记策略克服了尺寸和位点限制，这些限制阻碍了长度超过 200 nt 的标记 RNA 的常规生产。
Labeling of long RNA molecules in a site-specific yet generally applicable manner is integral to many spectroscopic applications. Here we present a novel covalent labeling approach that is site-specific and scalable to long intricately folded RNAs. In this approach, a custom-designed DNA strand that hybridizes to the RNA guides a reactive group to target a preselected adenine residue. The functionalized nucleotide along with the concomitantly oxidized 3′-terminus can subsequently be conjugated to two different fluorophores via bio-orthogonal chemistry. We validate this modular labeling platform using a regulatory RNA of 275 nucleotides, the btuB riboswitch of Escherichia coli, demonstrate its general applicability by modifying a base within a duplex, and show its site-selectivity in targeting a pair of adjacent adenines. Native folding and function of the RNA is confirmed on the single-molecule level by using FRET as a sensor to visualize and characterize the conformational equilibrium of the riboswitch upon binding of its cofactor adenosylcobalamin. The presented labeling strategy overcomes size and site constraints that have hampered routine production of labeled RNA that are beyond 200 nt in length.
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DOI：
10.1073/pnas.1218062110
发表时间：
2013-03-12
影响因子：
11.1
作者：
Haller, Andrea;Altman, Roger B.;Micura, Ronald
通讯作者：
Micura, Ronald
影响因子：
14.9
作者：
Cavaluzzi, MJ;Borer, PN
通讯作者：
Borer, PN
影响因子：
4.6
作者：
Ploetz E;Lerner E;Husada F;Roelfs M;Chung S;Hohlbein J;Weiss S;Cordes T
通讯作者：
Cordes T
影响因子：
4.5
作者：
Choudhary, Pallavi K.;Sigel, Roland K. O.
通讯作者：
Sigel, Roland K. O.
影响因子：
14.9
作者：
Nahvi, A;Barrick, JE;Breaker, RR
通讯作者：
Breaker, RR