Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.
Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.
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DOI：
10.1186/1480-9222-15-7
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发表时间：
2013-05-22
影响因子：
6.4
通讯作者：
Nemoto N
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Mochizuki Y;Kumachi S;Nishigaki K;Nemoto N
文库大小对于进化分子工程（定向进化）中的选择是至关重要的。尽管cDNA展示技术克服了mRNA展示的不稳定性，已成为一种很有前途的体外展示技术，但其产量低。在这项研究中，我们通过仔细检查制备过程中的每一步来提高cDNA展示分子的产量。我们发现核糖体与mRNA-蛋白质融合分子结合的空间位阻干扰了生物素-链霉亲和素的结合。此外，通过在His标签结合缓冲液中进行RNA酶消化以释放cDNA展示分子来减少缓冲液交换，改善了其His标签纯化。我们优化的条件提高了cDNA展示分子的产量超过10倍，目前使用的方法，使cDNA展示更实用的进化分子工程。
The library size is critical for selection in evolutionary molecular engineering (directed evolution). Although cDNA display has become a promising in vitro display technology by overcoming the instability of mRNA display, it is hindered by low yields. In this study, we improved the yield of cDNA display molecules by carefully examining each step of the preparation process. We found that steric hindrance of ribosomes binding to the mRNA-protein fusion molecules was interfering with biotin-streptavidin binding. Additionally, reducing buffer exchange by performing RNase digestion in the His-tag-binding buffer to release the cDNA display molecules improved their His-tag purification. Our optimized conditions have improved the yield of cDNA display molecules by more than 10 times over currently used methods, making cDNA display more practically available in evolutionary molecular engineering.
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