Directed evolution of phosphite dehydrogenase to cycle noncanonical redox cofactors via universal growth selection platform.
Directed evolution of phosphite dehydrogenase to cycle noncanonical redox cofactors via universal growth selection platform.
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DOI：
10.1038/s41467-022-32727-w
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发表时间：
2022-08-26
影响因子：
16.6
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中科院分区：
文献类型：
--
作者：
非经典氧化还原辅因子是生物转化中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸盐）（NAD(P)+）的有吸引力的低成本替代品。然而，设计酶来利用它们具有挑战性。在这里，我们提出了一个高通量定向进化平台，它将细胞生长与非经典辅因子烟酰胺单核苷酸（NMN+）的体内循环耦合起来。我们通过将大肠杆菌中生命必需的谷胱甘肽还原酶改造为完全依赖还原的 NMN+ (NMNH) 来实现这一目标。使用该系统，我们开发了一种亚磷酸脱氢酶 (PTDH) 来循环 NMN+，催化效率提高了约 147 倍，这意味着在无细胞生物转化中工业上可行的总周转数约为 45,000，而无需高辅因子浓度。此外，PTDH 变体还与另一种结构异常的非规范辅助因子 1-苄基烟酰胺 (BNA+) 一起表现出更高的活性，展示了其广泛的应用。结构模型预测揭示了一般设计原理，其中突变和较小的非规范辅助因子一起模拟较大的天然辅助因子 NAD(P)+ 的空间相互作用。利用非经典氧化还原辅因子（例如烟酰胺单核苷酸（NMN + ））进行酶工程改造具有挑战性。在此，作者报告了一种基于生长的 NMN + 还原酶工程选择平台，并展示了其在开发催化效率提高的亚磷酸脱氢酶中的应用。
Noncanonical redox cofactors are attractive low-cost alternatives to nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) (NAD(P)+) in biotransformation. However, engineering enzymes to utilize them is challenging. Here, we present a high-throughput directed evolution platform which couples cell growth to the in vivo cycling of a noncanonical cofactor, nicotinamide mononucleotide (NMN+). We achieve this by engineering the life-essential glutathione reductase in Escherichia coli to exclusively rely on the reduced NMN+ (NMNH). Using this system, we develop a phosphite dehydrogenase (PTDH) to cycle NMN+ with ~147-fold improved catalytic efficiency, which translates to an industrially viable total turnover number of ~45,000 in cell-free biotransformation without requiring high cofactor concentrations. Moreover, the PTDH variants also exhibit improved activity with another structurally deviant noncanonical cofactor, 1-benzylnicotinamide (BNA+), showcasing their broad applications. Structural modeling prediction reveals a general design principle where the mutations and the smaller, noncanonical cofactors together mimic the steric interactions of the larger, natural cofactors NAD(P)+. Engineering enzymes to utilize the noncanonical redox cofactors such as nicotinamide mononucleotide (NMN + ) is challenging. Here, the authors report a growth-based selection platform for NMN + -reducing enzyme engineering and show its application in developing a phosphite dehydrogenase with improved catalytic efficiency.
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