Endogenous U2·U5·U6 snRNA complexes in S. pombe are intron lariat spliceosomes.
Endogenous U2·U5·U6 snRNA complexes in S. pombe are intron lariat spliceosomes.
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DOI：
10.1261/rna.040980.113
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发表时间：
2014-03
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Moore MJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chen W;Shulha HP;Ashar-Patel A;Yan J;Green KM;Query CC;Rhind N;Weng Z;Moore MJ
在对数生长期间，粟酒裂殖酵母细胞含有丰富的含有 U2、U5 和 U6 snRNA 的高分子量复合物。陈等人。证明这些复合物主要是含有套索内含子和连接的外显子产物的化学后剪接体。这些复合物的形成可能是由于剪接体分解因子的不稳定关联所致，这可能解释了粟酒裂殖酵母提取物无法在体外催化前体 mRNA 剪接的原因。内含子从前 mRNA 中的切除是由剪接体介导的，剪接体是由 U1、U2、U4/U6 和 U5 snRNP 以及数十种相关蛋白组成的多兆道尔顿复合物。剪接体组装和拆卸是涉及多个稳定中间体的高度动态过程。在本研究中，我们利用分裂 TAP 标签方法大规模纯化粟酒裂殖酵母中丰富的内源性 U2·U5·U6 复合物。 RNAseq 揭示该复合物主要含有切除的内含子，表明它主要是 ILS（内含子套索剪接体）复合物。这些内源性 ILS 复合物对高盐和核酸酶消化具有显着的抵抗力。质谱分析在低盐、高盐和微球菌核酸酶处理的制剂中分别鉴定出 68、45 和 43 种蛋白质。粟酒裂殖酵母 ILS 复合物的蛋白质含量与之前报道的在体外组装在单个前 mRNA 上的人类剪接产物 (P) 和酿酒酵母 ILS 复合物的蛋白质含量非常相似。然而，ATP 依赖性 RNA 解旋酶 Brr2 在低盐制剂中要么低于化学计量，要么在高盐和 MNase 制剂中完全不存在。由于Brr2促进剪接体分解，其相对缺失可能解释了为什么ILS复合体积累对数生长的培养物以及粟酒裂殖酵母提取物无法支持体外剪接。
During logarithmic growth, Schizosaccharomyces pombe cells contain abundant, high-molecular-weight complexes harboring U2, U5, and U6 snRNAs. Chen et al. demonstrate that these complexes are predominantly post-chemistry spliceosomes containing lariat intron and ligated exon products. Build-up of these complexes, possibly due to unstable association of spliceosome disassembly factors, likely explains the inability of S. pombe extracts to catalyze pre-mRNA splicing in vitro. Excision of introns from pre-mRNAs is mediated by the spliceosome, a multi-megadalton complex consisting of U1, U2, U4/U6, and U5 snRNPs plus scores of associated proteins. Spliceosome assembly and disassembly are highly dynamic processes involving multiple stable intermediates. In this study, we utilized a split TAP-tag approach for large-scale purification of an abundant endogenous U2·U5·U6 complex from Schizosaccharomyces pombe. RNAseq revealed this complex to largely contain excised introns, indicating that it is primarily ILS (intron lariat spliceosome) complexes. These endogenous ILS complexes are remarkably resistant to both high-salt and nuclease digestion. Mass spectrometry analysis identified 68, 45, and 43 proteins in low-salt-, high-salt-, and micrococcal nuclease-treated preps, respectively. The protein content of a S. pombe ILS complex strongly resembles that previously reported for human spliced product (P) and Saccharomyces cerevisiae ILS complexes assembled on single pre-mRNAs in vitro. However, the ATP-dependent RNA helicase Brr2 was either substoichiometric in low-salt preps or completely absent from high-salt and MNase preps. Because Brr2 facilitates spliceosome disassembly, its relative absence may explain why the ILS complex accumulates logarithmically growing cultures and the inability of S. pombe extracts to support in vitro splicing.
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