小鼠Bmal1基因克隆与表达载体构建及其生物信息学分析
小鼠Bmal1基因克隆与表达载体构建及其生物信息学分析
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DOI：
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发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
陈华涛
中科院分区：
文献类型：
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作者：
江海圳;董浩;马白荣;李超;李丹;高登科;靳亚平;陈华涛
本研究旨在克隆小鼠 (Mus musculus) 生物钟基因Bmal1 的蛋白编码序列 (coding sequence, CDS)，构建其真核表达载体，并分析小鼠BMAL1 的生物学特性。从小鼠肝脏组织中提取总RNA，反转录得到cDNA，通过PCR 扩增获得小鼠Bmal1 基因CDS 区片段，并以同源重组的方式连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA 载体。经酶切和测序鉴定后将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-BMAL1。将pcDNA3.1-3HA-BMAL1 转染至HEK293T 细胞，并通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 和蛋白质免疫印迹 (WB) 检测BMAL1 在HEK293T 细胞中的表达。同时对小鼠Bmal1 基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。酶切和测序鉴定结果表明，pcDNA3.1-3HA-BMAL1 中插入的Bmal1 基因CDS 区片段正确。RT-qPCR 及WB 检测结果表明，相较于对照组，pcDNA3.1-3HA-BMAL1 转染组的HEK293T 细胞.中小鼠Bmal1 基因在mRNA 及蛋白水平的表达均大幅度升高。生物信息学分析结果表明，包括小鼠和人在内的多种哺乳动物的Bmal1 基因CDS 区具有较高的同源性；小鼠BMAL1 为不稳定蛋白，具有一定的亲水性，存在磷酸化位点23 个、乙酰化位点4 个、泛素化位点6 个；小鼠BMAL1 蛋白不存在跨膜区和信号肽，属于胞内蛋白；小鼠BMAL1 蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠和无规则卷曲组成，三级结构和人BMAL1 蛋白相比具有极高的相似性。双荧光素酶报告实验证明BMAL1 蛋白具有正常的转录调节活性。本研究成功克隆了小鼠Bmal1 基因的CDS 区片段，构建了小鼠pcDNA3.1-3HA-BMAL1 真核表达载体，验证了其在HEK293T 细胞中的表达效果，并利用生物信息学软件分析了小鼠Bmal1 基因及其编码蛋白的生物学特性。