Ribonucleoprotein particles containing non-coding Y RNAs, Ro60, La and nucleolin are not required for Y RNA function in DNA replication.
Ribonucleoprotein particles containing non-coding Y RNAs, Ro60, La and nucleolin are not required for Y RNA function in DNA replication.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0013673
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发表时间：
2010-10-27
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Krude T
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Langley AR;Chambers H;Christov CP;Krude T
Ro 核糖核蛋白颗粒 (Ro RNP) 由与 Ro60、La 和可能的其他蛋白质结合的非编码 Y RNA 组成。 Ro RNP 的生理功能存在争议，因为其不同成分的功能有所不同。我们最近表明，Y RNA 对于哺乳动物染色体 DNA 复制的启动至关重要，而 Ro RNP 则与 RNA 稳定性和 RNA 质量控制有关。因此，我们在此研究 Ro60、La 和核仁蛋白与 hY RNA 之间形成 RNP 对人类染色体 DNA 复制的功能影响。我们首先免疫沉淀 Ro60、La 和核仁素以及来自 HeLa 胞质细胞提取物的相关 hY RNA，并通过蛋白质印迹和定量 RT-PCR 分析这些沉淀的 RNP 的蛋白质和 RNA 组成。我们发现 Y RNA 存在于几种 RNP 复合物中。一种RNP包含Ro60、La和hY RNA，而不同的RNP包含核仁素和hY RNA。此外，提取物中约 50% 的 Y RNA 存在于这两个 RNP 之外。接下来，我们从胞质提取物中免疫去除这些 RNP 复合物，并测试去除的提取物在人类无细胞系统中重建 DNA 复制的能力。我们发现，从胞质提取物中去除这些 RNP 复合物并不会抑制体外 DNA 复制。最后，我们测试了过量的重组纯 Ro 或 La 蛋白是否会抑制该无细胞系统中 Y RNA 依赖性 DNA 复制。我们发现 Ro60 和 La 蛋白在体外不会抑制 DNA 复制。我们得出的结论是，含有 hY RNA 和 Ro60、La 或核仁素的 RNP 并不是人类无细胞系统中染色体 DNA 复制中 hY RNA 功能所必需的，这可以由这些 RNP 之外的 Y RNA 介导。这些数据表明，Y RNA 可以根据相关蛋白支持不同的细胞功能。
Ro ribonucleoprotein particles (Ro RNPs) consist of a non-coding Y RNA bound by Ro60, La and possibly other proteins. The physiological function of Ro RNPs is controversial as divergent functions have been reported for its different constituents. We have recently shown that Y RNAs are essential for the initiation of mammalian chromosomal DNA replication, whereas Ro RNPs are implicated in RNA stability and RNA quality control. Therefore, we investigate here the functional consequences of RNP formation between Ro60, La and nucleolin proteins with hY RNAs for human chromosomal DNA replication. We first immunoprecipitated Ro60, La and nucleolin together with associated hY RNAs from HeLa cytosolic cell extract, and analysed the protein and RNA compositions of these precipitated RNPs by Western blotting and quantitative RT-PCR. We found that Y RNAs exist in several RNP complexes. One RNP comprises Ro60, La and hY RNA, and a different RNP comprises nucleolin and hY RNA. In addition about 50% of the Y RNAs in the extract are present outside of these two RNPs. Next, we immunodepleted these RNP complexes from the cytosolic extract and tested the ability of the depleted extracts to reconstitute DNA replication in a human cell-free system. We found that depletion of these RNP complexes from the cytosolic extract does not inhibit DNA replication in vitro. Finally, we tested if an excess of recombinant pure Ro or La protein inhibits Y RNA-dependent DNA replication in this cell-free system. We found that Ro60 and La proteins do not inhibit DNA replication in vitro. We conclude that RNPs containing hY RNAs and Ro60, La or nucleolin are not required for the function of hY RNAs in chromosomal DNA replication in a human cell-free system, which can be mediated by Y RNAs outside of these RNPs. These data suggest that Y RNAs can support different cellular functions depending on associated proteins.
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