构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究

构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究
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DOI：
10.3969/j.issn.1674-8115.2021.03.002
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发表时间：
2021
期刊：
上海交通大学学报. 医学版
影响因子：
--
通讯作者：
唐元家
唐元家
中科院分区：
其他
文献类型：
--
作者：
赵艳娜;邱荣;沈南;唐元家

文献摘要

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目的·结合Dox诱导型单链导向RNA (single guide RNA,sgRNA)表达载体和Cas9转基因小鼠,构建诱导型CRISPR/Cas9系统用于小鼠免疫细胞基因功能研究。方法·根据四环素诱导表达系统原理,基因合成U6-TetO-sgRNA和EF1α-T2A-Puro-BFP-T2ATetR片段。通过同源重组将2个片段组装进反转录病毒载体骨架,获得Dox诱导型sgRNA反转录病毒载体。为了验证系统有效性,分离Cas9转基因小鼠骨髓细胞并诱导其向巨噬细胞方向分化。设计对照(non-targeting control,NC)组和实验组(靶向F4/80)的sgRNA,利用反转录病毒感染细胞,分化条件设置添加Dox组(Dox+)和不添加Dox组(Dox-)。通过流式细胞术和T7核酸内切酶Ⅰ (T7 endonuclease Ⅰ,T7EⅠ)实验检测基因敲除效果。结果·①成功构建Dox诱导型sgRNA反转录病毒表达载体和Cas9转基因小鼠。②流式结果显示,在NC Dox-组、NCDox+组和F4/80 Dox-组中,几乎无F4/80阴性细胞群体;而在F4/80 Dox+组中,F4/80阴性细胞群体高达50%。③T7EⅠ结果显示,在F4/80 Dox-组中,DNA条带完整,而在F4/80 Dox+组中发生基因突变,DNA条带被切开。结论·结合Dox诱导型sgRNA表达载体和Cas9转基因小鼠,成功构建诱导型CRISPR/Cas9系统。利用该系统成功在小鼠免疫细胞中实现可诱导性基因敲除。