A method to quantify FRET stoichiometry with phasor plot analysis and acceptor lifetime ingrowth.
A method to quantify FRET stoichiometry with phasor plot analysis and acceptor lifetime ingrowth.
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DOI：
10.1016/j.bpj.2015.01.012
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发表时间：
2015-03-10
影响因子：
3.4
通讯作者：
Kaminski, Clemens F.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chen, WeiYue;Avezov, Edward;Schlachter, Simon C.;Gielen, Fabrice;Laine, Romain F.;Harding, Heather P.;Hollfelder, Florian;Ron, David;Kaminski, Clemens F.
FRET 广泛用于生物样品中蛋白质-蛋白质相互作用的研究。然而，很难通过未知化学计量样品中分子间 FRET 信号来量化 FRET 效率 (E) 和分子相互作用的亲和力 (Kd)。在这里，我们提出了一种同时量化每个图像像素中全套相互作用参数的方法，包括结合供体和受体的分数、局部蛋白质浓度和解离常数。该方法利用来自供体和受体分子的荧光寿命信息，并利用相量图方法的线性特性。我们通过测定标记版本的谷胱甘肽和谷胱甘肽 S-转移酶之间的结合亲和力，以及通过测定竞争剂浓度，在体外微流体装置和细胞中证明了我们的方法的能力。通过模拟探索该方法的潜力。
FRET is widely used for the study of protein-protein interactions in biological samples. However, it is difficult to quantify both the FRET efficiency (E) and the affinity (Kd) of the molecular interaction from intermolecular FRET signals in samples of unknown stoichiometry. Here, we present a method for the simultaneous quantification of the complete set of interaction parameters, including fractions of bound donors and acceptors, local protein concentrations, and dissociation constants, in each image pixel. The method makes use of fluorescence lifetime information from both donor and acceptor molecules and takes advantage of the linear properties of the phasor plot approach. We demonstrate the capability of our method in vitro in a microfluidic device and also in cells, via the determination of the binding affinity between tagged versions of glutathione and glutathione S-transferase, and via the determination of competitor concentration. The potential of the method is explored with simulations.
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影响因子：
4
作者：
Padilla-Parra, Sergi;Tramier, Marc
通讯作者：
Tramier, Marc
影响因子：
2
作者：
Leray, A.;Spriet, C.;Heliot, L.
通讯作者：
Heliot, L.
影响因子：
2.5
作者：
Hinde, Elizabeth;Digman, Michelle A.;Gratton, Enrico
通讯作者：
Gratton, Enrico
DOI：
10.1039/c3an36798c
发表时间：
2013-04-07
期刊：
The Analyst
影响因子：
--
作者：
Chan FT;Kaminski Schierle GS;Kumita JR;Bertoncini CW;Dobson CM;Kaminski CF
通讯作者：
Kaminski CF
影响因子：
3.5
作者：
Forde, Toni S.;Hanley, Quentin S.
通讯作者：
Hanley, Quentin S.