Chemoenzymatic Semi-synthesis Enables Efficient Production of Isotopically Labeled α-Synuclein with Site-Specific Tyrosine Phosphorylation.
Chemoenzymatic Semi-synthesis Enables Efficient Production of Isotopically Labeled α-Synuclein with Site-Specific Tyrosine Phosphorylation.
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DOI：
10.1002/cbic.202000742
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发表时间：
2021-04-16
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Petersson EJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Pan B;Park JH;Ramlall T;Eliezer D;Rhoades E;Petersson EJ
翻译后修饰(PTM)会影响α-突触核蛋白(αS)的正常功能和病理，这是一种与帕金森病有关的淀粉样原纤维形成蛋白。最近发现，αS酪氨酸39的磷酸化对纤维形成动力学表现出剂量依赖性的影响，并改变了纤维的形态。现有的获取位点特异的磷酸化αS用于生化研究的方法包括通过天然化学连接的全合成或半合成以及化学酶法磷酸化多肽，然后再用化学连接的方法。在此，我们研究了一种简化的方法，通过在大肠杆菌中共表达一个激酶和一个蛋白片段来大量生产磷酸化的αS。我们还介绍了使用硫代乙酸甲酯(MTG)实现一锅NCL和脱硫。我们将我们的优化方法与以前的报告进行了比较，结果表明，我们可以通过使用MTG的化学酶方法获得最高的位点特异性磷酸化蛋白质产量，并且我们的策略非常适合于生产用于核磁共振研究的15N标记的磷酸化蛋白质。比较了几种制备α-突触核蛋白Tyr39位磷酸化的方法(αS-PY39)，并证明了一锅连接的化学酶方法的价值，特别是对于生产核磁共振研究用的15N标记蛋白。
Post-translational modifications (PTMs) can affect the normal function and pathology of α-synuclein (αS), an amyloid fibril forming protein linked to Parkinson’s disease. Phosphorylation of αS Tyr39 has recently been found to display a dose-dependent effect on fibril formation kinetics and to alter the morphology of the fibrils. Existing methods to access site-specifically phosphorylated αS for biochemical studies include total or semi-synthesis by native chemical ligation (NCL) as well as chemoenzymatic methods to phosphorylate peptides, followed by NCL. Here we investigated a streamlined method to produce large quantities of phosphorylated αS by co-expressing a kinase with a protein fragment in E. coli. We also introduced the use of methyl thioglycolate (MTG) to enable one pot NCL and desulfurization. We compare our optimized methods to previous reports and show that we can achieve the highest yields of site-specifically phosphorylated protein through chemoenzymatic methods using MTG, and that our strategy is uniquely well-suited to producing 15N labeled, phosphorylated protein for NMR studies. Several strategies for producing α-synuclein phosphorylated at Tyr39 (αS-pY39) are compared and the value of a chemoenzymatic strategy with one-pot ligation is demonstrated, in particular for producing 15N labeled protein for NMR studies.
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