Role of the EF-hand and coiled-coil domains of human Rab44 in localisation and organelle formation.
Role of the EF-hand and coiled-coil domains of human Rab44 in localisation and organelle formation.
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DOI：
10.1038/s41598-020-75897-7
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发表时间：
2020-11-05
影响因子：
4.6
通讯作者：
Tsukuba T
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ogawa K;Kadowaki T;Tokuhisa M;Yamaguchi Y;Umeda M;Tsukuba T
Rab 44是一个大的Rab GT3，含有一个氨基末端EF-手结构域，一个卷曲螺旋结构域和一个羧基末端Rab GT3结构域。然而，EF-手和卷曲螺旋结构域的作用仍然不清楚。在这里，我们构建了人Rab 44的各种缺失和点突变体。当在HeLa细胞中过表达时，野生型Rab 44（hWT）形成环状结构，并部分定位于溶酶体。显性失活突变体hT 847 N定位于溶酶体和胞浆，而组成型活性突变体hQ 892 L形成环状结构，部分定位于质膜和细胞核。hΔEF、hΔcoil和h826-1021突变体也形成环状结构;然而，它们的定位模式与hWT不同。LysoTracker实时成像分析显示，LysoTracker阳性囊泡的大小被hC 1019 A和hΔEF以外的所有其他突变改变。用离子霉素（一种Ca 2+载体）处理可诱导hWT和hΔcoil易位到质膜和胞质溶胶中，但对hΔEF和h826-1021突变体的定位没有影响。因此，EF-手结构域可能需要Rab 44的部分易位到质膜和胞质溶胶后瞬时Ca 2+流入，卷曲螺旋结构域似乎是重要的本地化和细胞器的形成。
Rab44 is a large Rab GTPase that contains an amino-terminal EF-hand domain, a coiled-coil domain, and a carboxyl-terminal Rab GTPase domain. However, the roles of the EF-hand and coiled-coil domains remain unclear. Here, we constructed various deletion and point mutants of human Rab44. When overexpressed in HeLa cells, the wild-type Rab44 (hWT) formed ring-like structures, and partially localised to lysosomes. The dominant negative mutant, hT847N, localised to lysosomes and the cytosol, while the constitutively active mutant, hQ892L, formed ring-like structures, and partially localised to the plasma membrane and nuclei. The hΔEF, hΔcoil, and h826-1021 mutants also formed ring-like structures; however, their localisation patterns differed from hWT. Analysis of live imaging with LysoTracker revealed that the size of LysoTracker-positive vesicles was altered by all other mutations than the hC1019A and hΔEF. Treatment with ionomycin, a Ca2+ ionophore, induced the translocation of hWT and hΔcoil into the plasma membrane and cytosol, but had no effect on the localisation of the hΔEF and h826-1021 mutants. Thus, the EF- hand domain is likely required for the partial translocation of Rab44 to the plasma membrane and cytosol following transient Ca2+ influx, and the coiled-coil domain appears to be important for localisation and organelle formation.
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