High-fidelity CRISPR/Cas9- based gene-specific hydroxymethylation rescues gene expression and attenuates renal fibrosis.
High-fidelity CRISPR/Cas9- based gene-specific hydroxymethylation rescues gene expression and attenuates renal fibrosis.
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DOI：
10.1038/s41467-018-05766-5
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发表时间：
2018-08-29
影响因子：
16.6
通讯作者：
Zeisberg M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Xu X;Tan X;Tampe B;Wilhelmi T;Hulshoff MS;Saito S;Moser T;Kalluri R;Hasenfuss G;Zeisberg EM;Zeisberg M
虽然通过异常启动子甲基化抑制特定基因有助于不同的疾病，包括器官纤维化，但基因特异性再激活技术尚未用于治疗。泰特酶催化甲基化DNA的羟甲基化，重新激活基因表达。我们在这里报告了通过将核酸内切酶失活的高保真Cas9（dHFCas 9）融合到TET 3催化结构域（TET 3CD）来产生高保真CRISPR/Cas9基基因特异性双加氧酶，TET 3催化结构域通过引导RNA（sgRNA）靶向特定基因。我们证明了这种技术在体外不同细胞类型中的四种不同抗纤维化基因中的应用，其中包括RASAL 1和Klotho，两者都在肾纤维化中高度甲基化。此外，Rasal 1靶向融合蛋白向间质细胞和Klotho靶向融合蛋白向肾小管上皮细胞的体内慢病毒递送各自导致特异性基因再激活和纤维化减弱，从而在疾病模型中提供基因特异性去甲基化技术。由于异常启动子甲基化导致的基因表达抑制有助于器官纤维化。在这里，作者将失活的Cas9与TET 3催化结构域偶联，以诱导四种抗纤维化基因的表达，并表明慢病毒介导的递送在小鼠模型中有效减少肾纤维化。
While suppression of specific genes through aberrant promoter methylation contributes to different diseases including organ fibrosis, gene-specific reactivation technology is not yet available for therapy. TET enzymes catalyze hydroxymethylation of methylated DNA, reactivating gene expression. We here report generation of a high-fidelity CRISPR/Cas9-based gene-specific dioxygenase by fusing an endonuclease deactivated high-fidelity Cas9 (dHFCas9) to TET3 catalytic domain (TET3CD), targeted to specific genes by guiding RNAs (sgRNA). We demonstrate use of this technology in four different anti-fibrotic genes in different cell types in vitro, among them RASAL1 and Klotho, both hypermethylated in kidney fibrosis. Furthermore, in vivo lentiviral delivery of the Rasal1-targeted fusion protein to interstitial cells and of the Klotho-targeted fusion protein to tubular epithelial cells each results in specific gene reactivation and attenuation of fibrosis, providing gene-specific demethylating technology in a disease model. Suppression of gene expression due to aberrant promoter methylation contributes to organ fibrosis. Here, the authors couple a deactivated Cas9 to the TET3 catalytic domain to induce expression of four antifibrotic genes, and show that lentiviral-mediated delivery is effective in reducing kidney fibrosis in mouse models.
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