Identification and relative quantification of membrane proteins by surface biotinylation and two‐dimensional peptide mapping
Identification and relative quantification of membrane proteins by surface biotinylation and two‐dimensional peptide mapping
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通过表面生物素化和二维肽图对膜蛋白进行鉴定和相对定量
DOI：
10.1002/pmic.200401163
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发表时间：
2005
期刊：
影响因子：
3.4
通讯作者：
G. Elia
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Simon Scheurer;Jascha;C. Roesli;R. Brunisholz;F. Potthast;R. Schlapbach;D. Neri;G. Elia
膜蛋白在生物过程中起着核心作用，但使用二维凝胶电泳对其进行分离和定量通常受到其溶解性差和相对较低丰度的限制。我们现在提出了一种方法，用于同时回收，分离，鉴定和相对定量的膜蛋白，其选择性共价修饰与可切割的生物素衍生物。细胞裂解后，在链霉亲和素包被的树脂上纯化生物素化蛋白，并进行蛋白水解消化。通过高压液相色谱法和质谱法分析所得肽，从而产生二维肽图。在存在内标物的情况下，使用基质辅助激光解吸/电离-肽的飞行时间信号强度来定量来自在不同实验条件下处理的细胞的膜蛋白的相对丰度。作为实验示例，我们呈现了（i）BSA掺入的人胚肾膜蛋白提取物的分析，以及（ii）在常氧和缺氧条件下培养的人脐静脉内皮细胞的膜蛋白的分析。最后一项研究允许血管内皮-钙粘蛋白/肌动蛋白/连环蛋白复合物的恢复，揭示了在2%O2浓度下β-连环蛋白的积累增加。
Membrane proteins play a central role in biological processes, but their separation and quantification using two‐dimensional gel electrophoresis is often limited by their poor solubility and relatively low abundance. We now present a method for the simultaneous recovery, separation, identification, and relative quantification of membrane proteins, following their selective covalent modification with a cleavable biotin derivative. After cell lysis, biotinylated proteins are purified on streptavidin‐coated resin and proteolytically digested. The resulting peptides are analyzed by high‐pressure liquid chromatography and mass spectrometry, thus yielding a two‐dimensional peptide map. Matrix assisted laser desorption/ionization‐time of flight signal intensity of peptides, in the presence of internal standards, is used to quantify the relative abundance of membrane proteins from cells treated in different experimental conditions. As experimental examples, we present (i) an analysis of a BSA‐spiked human embryonic kidney membrane protein extract, and (ii) an analysis of membrane proteins of human umbilical vein endothelial cells cultured in normoxic and hypoxic conditions. This last study allowed the recovery of the vascular endothelial‐cadherin/actin/catenin complex, revealing an increased accumulation of beta‐catenin at 2% O2 concentration.
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DOI：
10.1164/ajrccm.158.6.9804076
发表时间：
1998-12-01
影响因子：
24.7
作者：
Berg, JT;Breen, EC;West, JB
通讯作者：
West, JB
DOI：
10.1016/s0022-2143(98)90131-7
发表时间：
1998-12-01
期刊：
JOURNAL OF LABORATORY AND CLINICAL MEDICINE
影响因子：
--
作者：
Phelan, MW;Forman, LW;Faller, DV
通讯作者：
Faller, DV
影响因子：
7.4
作者：
Zhao, YX;Zhang, W;Zhao, YM
通讯作者：
Zhao, YM
DOI：
10.1016/s0006-291x(03)00313-9
发表时间：
2003-03-28
影响因子：
3.1
作者：
Biswas, P;Canosa, S;Madri, JA
通讯作者：
Madri, JA
影响因子：
7.4
作者：
McCormack, AL;Schieltz, DM;Yates, JR
通讯作者：
Yates, JR