Highly efficient CRISPR-mediated large DNA docking and multiplexed prime editing using a single baculovirus.
Highly efficient CRISPR-mediated large DNA docking and multiplexed prime editing using a single baculovirus.
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DOI：
10.1093/nar/gkac587
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发表时间：
2022-07-22
影响因子：
14.9
通讯作者：
Berger, Imre
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Aulicino, Francesco;Pelosse, Martin;Toelzer, Christine;Capin, Julien;Ilegems, Erwin;Meysami, Parisa;Rollarson, Ruth;Berggren, Per-Olof;Dillingham, Mark Simon;Schaffitzel, Christiane;Saleem, Moin A.;Welsh, Gavin, I;Berger, Imre
基于crispr的精确基因编辑需要同时将多个组分递送到活细胞中，这迅速超过了传统病毒载体系统的运载能力。这一挑战是基因组工程应用的主要障碍。在这里，我们利用杆状病毒无与伦比的异源DNA装载能力来解决人类细胞中的这一瓶颈。通过在单个快速组装的杆状病毒载体上编码Cas9、sgRNA和供体DNA，我们在内含子β-肌动蛋白（ACTB）位点实现了高达30%的全外显子替换，包括非常大的DNA有效载荷的位点特异性对接。我们使用我们的方法来挽救类固醇抵抗性肾病综合征（SRNS）患者衍生足细胞中野生型足蛋白的表达。我们展示了单个杆状病毒载体递送单个和多个引物编辑工具包，实现了高达100%的无切割DNA搜索和替换干预，没有可检测的索引。综上所述，我们为单碱基到多基因水平的基因组干预提供了一个多功能的递送平台，解决了目前对一个强大的递送系统的需求，该系统可以容纳当前和未来的CRISPR技术，而不需要承担有限的货运能力。
CRISPR-based precise gene-editing requires simultaneous delivery of multiple components into living cells, rapidly exceeding the cargo capacity of traditional viral vector systems. This challenge represents a major roadblock to genome engineering applications. Here we exploit the unmatched heterologous DNA cargo capacity of baculovirus to resolve this bottleneck in human cells. By encoding Cas9, sgRNA and Donor DNAs on a single, rapidly assembled baculoviral vector, we achieve with up to 30% efficacy whole-exon replacement in the intronic β-actin (ACTB) locus, including site-specific docking of very large DNA payloads. We use our approach to rescue wild-type podocin expression in steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS) patient derived podocytes. We demonstrate single baculovirus vectored delivery of single and multiplexed prime-editing toolkits, achieving up to 100% cleavage-free DNA search-and-replace interventions without detectable indels. Taken together, we provide a versatile delivery platform for single base to multi-gene level genome interventions, addressing the currently unmet need for a powerful delivery system accommodating current and future CRISPR technologies without the burden of limited cargo capacity.
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