Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips.
Massively Parallel Biophysical Analysis of CRISPR-Cas Complexes on Next Generation Sequencing Chips.
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DOI：
10.1016/j.cell.2017.05.044
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发表时间：
2017-06-29
期刊：
影响因子：
64.5
通讯作者：
Finkelstein IJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Jung C;Hawkins JA;Jones SK Jr;Xiao Y;Rybarski JR;Dillard KE;Hussmann J;Saifuddin FA;Savran CA;Ellington AD;Ke A;Press WH;Finkelstein IJ
CRISPR-Cas核蛋白通过与crRNA的碱基配对来靶向外源DNA。然而，脱靶DNA序列上的蛋白质结合和核酸酶激活的定量描述仍然难以捉摸。在这里，我们描述了一个芯片杂交关联映射平台(CHAMP)，它重新调整了下一代测序芯片的用途，以同时测量蛋白质和~107个独特DNA序列之间的相互作用。利用CHAMP，我们首次全面调查了I-E型CRISPR-CaS(级联)复合体和Cas3核酸酶识别DNA的情况。对突变的靶序列和人类基因组DNA的分析表明，Cascade识别一个扩展的Protspacer邻近基序(PAM)。CASCADE以令人惊讶的三核苷酸周期识别DNA。PAM和PAM-近端核苷酸的同一性通过释放Cse1亚单位来控制Cas3的募集。这些发现被用来开发一个管理脱靶DNA结合的生物物理约束的模型。CHAMP为高通量、定量分析合成和基因组DNA上的蛋白质-DNA相互作用提供了一个框架。
CRISPR-Cas nucleoproteins target foreign DNA via base pairing with a crRNA. However, a quantitative description of protein binding and nuclease activation at off-target DNA sequences remains elusive. Here, we describe a chip-hybridized association-mapping platform (CHAMP) that repurposes next-generation sequencing chips to simultaneously measure the interactions between proteins and ~107 unique DNA sequences. Using CHAMP, we provide the first comprehensive survey of DNA recognition by a Type I-E CRISPR-Cas (Cascade) complex and Cas3 nuclease. Analysis of mutated target sequences and human genomic DNA reveal that Cascade recognizes an extended protospacer adjacent motif (PAM). Cascade recognizes DNA with a surprising three-nucleotide periodicity. The identity of the PAM and the PAM-proximal nucleotides control Cas3 recruitment by releasing the Cse1 subunit. These findings are used to develop a model for the biophysical constraints governing off-target DNA binding. CHAMP provides a framework for high-throughput, quantitative analysis of protein-DNA interactions on synthetic and genomic DNA.
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DOI：
10.1038/nrg2749
发表时间：
2010-03
期刊：
Nature reviews. Genetics
影响因子：
--
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
16
作者：
Leenay RT;Maksimchuk KR;Slotkowski RA;Agrawal RN;Gomaa AA;Briner AE;Barrangou R;Beisel CL
通讯作者：
Beisel CL
影响因子：
48
作者：
Langmead, Ben;Salzberg, Steven L.
通讯作者：
Salzberg, Steven L.
影响因子：
16
作者：
Blosser, Timothy R.;Loeff, Luuk;Westra, Edze R.;Vlot, Marnix;Kunne, Tim;Sobota, Malgorzata;Dekker, Cees;Brouns, Stan J. J.;Joo, Chirlmin
通讯作者：
Joo, Chirlmin
影响因子：
64.5
作者：
Hsu PD;Lander ES;Zhang F
通讯作者：
Zhang F