Rapid metabolic pathway assembly and modification using serine integrase site-specific recombination.
Rapid metabolic pathway assembly and modification using serine integrase site-specific recombination.
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DOI：
10.1093/nar/gkt1101
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发表时间：
2014-02
影响因子：
14.9
通讯作者：
Rosser SJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Colloms SD;Merrick CA;Olorunniji FJ;Stark WM;Smith MC;Osbourn A;Keasling JD;Rosser SJ
合成生物学需要有效的方法将DNA部件组装成设备，并在制造后对这些设备进行修改。在这里，我们展示了一种使用ϕC31整合酶进行位点特异性重组的简便快速的DNA片段组装程序。利用6个具有不同重叠序列的正交性attP/attB重组位点对，我们可以将最多5个DNA片段按规定的顺序组装在一起，并在一次重组反应中将它们插入到质粒载体中。ϕC31整合酶介导的组装是高效的，允许生产适合组合基因组装策略的大型文库。得到的组件包含由重组位点分隔的DNA盒阵列，这些DNA盒可用于通过进一步重组来操纵组件。我们举例说明了这些程序的用途：(I)组装包含三个、四个或五个基因的功能代谢途径；(Ii)通过随机化基因顺序或核糖体结合部位强度的组合组装来优化两个模型代谢途径的生产率；以及(Iii)通过基因替换或添加来修改组装的代谢途径。
Synthetic biology requires effective methods to assemble DNA parts into devices and to modify these devices once made. Here we demonstrate a convenient rapid procedure for DNA fragment assembly using site-specific recombination by ϕC31 integrase. Using six orthogonal attP/attB recombination site pairs with different overlap sequences, we can assemble up to five DNA fragments in a defined order and insert them into a plasmid vector in a single recombination reaction. ϕC31 integrase-mediated assembly is highly efficient, allowing production of large libraries suitable for combinatorial gene assembly strategies. The resultant assemblies contain arrays of DNA cassettes separated by recombination sites, which can be used to manipulate the assembly by further recombination. We illustrate the utility of these procedures to (i) assemble functional metabolic pathways containing three, four or five genes; (ii) optimize productivity of two model metabolic pathways by combinatorial assembly with randomization of gene order or ribosome binding site strength; and (iii) modify an assembled metabolic pathway by gene replacement or addition.
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