siRNA特异性干扰EgTPx基因表达对细粒棘球蚴 原头节DNA氧化损伤机制的影响
siRNA特异性干扰EgTPx基因表达对细粒棘球蚴 原头节DNA氧化损伤机制的影响
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DOI：
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发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
王建华
中科院分区：
文献类型：
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作者：
郑璇;卢帅;文丽梅;吕国栋;李亚芬;田春艳;赵军;王建华
目的 研究小干扰 ＲＮＡ （ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ，ｓｉＲＮＡ ）特异性干扰 ＥｇＴＰｘ 基因表达后对细粒棘球蚴（ Ｅｃｈｉ －ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ ，Ｅｇ ）原头节ＤＮＡ 氧化损伤机制的影响。 方法 利用电穿孔法将 ＥｇＴＰｘ － ｓｉＲＮＡ 干扰序列转染细粒棘球蚴原头节，实验分为 ＥｇＴＰｘ － ｓｉＲＮＡ － ６０ 、 １１５ 、 ２５０ 干扰组，阴性对照组和空白对照组。电转 ３ｄ 后，协同自然状态下.原头节体外耐受 Ｈ ２ Ｏ ２ 最大浓度干预 １ｈ ，综合伊红拒染试验和碱性磷酸酶检测干扰前后原头节活性变化及 ｑＲＴ － ＰＣＲ检测干扰前后 ＥｇＴＰｘ － ｍＲＮＡ 表达水平变化筛选最佳 ＥｇＴＰｘ － ｓｉＲＮＡ 干扰序列。采用单细胞凝胶电泳法（彗星试验）检测干扰前后原头节 ＤＮＡ 氧化损伤程度变化；采用试剂盒法检测原头节体内活性氧（ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ， ＲＯＳ ）含量，分析 ｓｉＲＮＡ 干扰对 ＤＮＡ 氧化损伤机制的影响。 结果 自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受 Ｈ ２ Ｏ ２ 的最大浓度为０．４ｍｍｏｌ ／ Ｌ ，干预时间为 １ｈ ；电穿孔法将绿色荧光干扰序列导入原头节体内，实验组和阴性对照组的原头节体内均有绿色荧光斑点，而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点。导入 ｓｉＲＮＡ 后通过伊红拒染试验、碱性磷酸酶活性检测及ｑＲＴ － ＰＣＲ筛选出最佳干扰序列为 ＥｇＴＰｘ－ ｓｉＲＮＡ － ６０ ；彗星试验显示干扰 ＥｇＴＰｘ基因表达后 ＥｇＴＰｘ － ｓｉＲＮＡ － ６０干扰组原头节 ＤＮＡ碎片离开核向阳极迁移形成拖尾， ＥｇＴＰｘ － ｓｉＲＮＡ － ６０干扰组彗星尾距 ＯＴＭ 值为１２．８６０ ２±２．５３７ ７ ，与阴性对照组（ ０．０５５ ８±０．０１０ ３ ）和空白对照组（０．０３７ ２±０．００９ ８ ）相比差异有统计学意义（ ｔ 值分别为１１．２５１和１２．８４５，均Ｐ＜０．０１）；经 ＥｇＴＰｘ － ｓｉＲＮＡ －６０序列干扰后原头节体内 ＲＯＳ含量（ １３．９７８ ６±０．２３３ ０ ） Ａ．Ｕ．与阴性对照组（３．２８１ ７±０．０５２ ５ ） Ａ．Ｕ．和空白对照组（ ３．０１８ ２±０．０７６ ９ ） Ａ．Ｕ．比较差异有统计学意义（ ｔ 值分别为８．９２６和９．３１４ ，均 Ｐ ＜０．０１ ）。 结论 ＥｇＴＰｘ基因在细粒棘球蚴原头节 ＤＮＡ 氧化损伤过程中发挥重要作用， ＥｇＴＰｘ － ｓｉＲＮＡ － ６０可特异性干扰 ＥｇＴＰｘ基因的表达，并降低原头节修复 ＤＮＡ氧化损伤的能力。