Purification and N-terminal sequence analysis of pea chloroplast protein synthesis factor EF-G.
Purification and N-terminal sequence analysis of pea chloroplast protein synthesis factor EF-G.
复制标题
豌豆叶绿体蛋白合成因子EF-G的纯化及N端序列分析。
DOI：
10.1006/abbi.1994.1016
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发表时间：
1994
影响因子：
3.9
通讯作者：
Breitenberger,CA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Akkaya,MS;Welcsh,PL;Wolfe,MA;Duerr,BK;Becktel,WJ;Breitenberger,CA
叶绿体蛋白合成延伸因子 G (chlEF-G) 已从光诱导豌豆 (Pisum sativum) 幼苗的全细胞提取物中纯化出来。纯化方案的第一步依赖于在抗生素夫西地酸存在下细胞器 EF-G 对大肠杆菌糖体的亲和力。细胞器 EF-G、E 之间的复合物。通过高速离心分离大肠杆菌糖体、GDP和夫西地酸。通过高盐从该复合物中洗脱出的最大主要蛋白质的表观分子量为 86,000，仅是来自黑暗生长幼苗的类似制剂的次要成分。相同的多肽在 Waters Protein-Pak 200SW 柱上通过尺寸排阻 HPLC 与 EF-G 活性进行共纯化。 ChlEF-G 的 N 端氨基酸序列已通过凝胶纯化蛋白的直接测序确定。与许多在输入叶绿体后进行加工的蛋白质一样，它具有 N 末端丙氨酸残基。推定的chlEF-G基因的一部分已使用对应于纯化蛋白的N端氨基酸序列和其他延伸因子的GTP结合域内高度保守的序列的寡核苷酸进行扩增。推导的氨基酸序列与大豆叶绿体EF-G基因产物的相应区域显示出高序列同一性，与细菌EF-G的相似性稍低，与线粒体EF-G和真核细胞质EF-2基因的同源性较低。 ChlEF-G 基因似乎由豌豆中的双拷贝基因家族和拟南芥中的单拷贝基因编码。
Chloroplast protein synthesis elongation factor G (chlEF-G) has been purified from whole-cell extracts of light-induced pea (Pisum sativum) seedlings. The first step in the purification scheme relies on the affinity of organellar EF-G forEscherichia coliribosomes in the presence of the antibiotic, fusidic acid. A complex between organellar EF-G,E. coliribosomes, GDP, and fusidic acid was isolated by high-speed centrifugation. The largest major protein eluted from this complex by high salt has an apparent molecular weight of 86,000 and is only a minor component of similar preparations from dark-grown seedlings. The same polypeptide copurifies with EF-G activity upon size exclusion HPLC on a Waters Protein-Pak 200SW column. The N-terminal amino acid sequence of chlEF-G has been determined by direct sequencing of gel-purified protein. Like many proteins that are processed upon import into chloroplasts, it has an N-terminal alanine residue. Part of the putative chlEF-G gene has been amplified using oligonucleotides corresponding to the N-terminal amino acid sequence of the purified protein and to highly conserved sequences within the GTP-binding domains of other elongation factors. The deduced amino acid sequence displays high sequence identity to the corresponding region of the chloroplast EF-G gene product from soybean, somewhat less similarity to bacterial EF-Gs, and only low homology to mitochondrial EF-G and to eukaryotic cytoplasmic EF-2 genes. The chlEF-G gene appears to be encoded by a two-copy gene family in pea and a single-copy gene inArabidopsis thaliana.
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