A single vesicle-vesicle fusion assay for in vitro studies of SNAREs and accessory proteins.
A single vesicle-vesicle fusion assay for in vitro studies of SNAREs and accessory proteins.
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DOI：
10.1038/nprot.2012.020
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发表时间：
2012-05
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）蛋白是一类高度调节的膜蛋白，其驱动两个不同的脂质双层有效合并成一个互连结构。该协议描述了我们的荧光共振能量转移（FRET）为基础的单一囊泡囊泡融合检测SNARE和辅助蛋白。描述了脂质混合（FRET对作为膜中的亲脂性染料）和内容物混合测定（FRET对存在于通过与互补DNA杂交而成为线性的DNA发夹上）。这些测定可用于检测子阶段，例如对接、半融合、以及孔扩张和完全融合。详细介绍了流动池的制备、蛋白质重组囊泡的制备、数据采集和分析。这些测定可用于研究各种SNARE蛋白、辅助蛋白的作用以及不同脂质组合物对特定融合步骤的影响。完成该方案一轮所需的总时间为3-6 d。
SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins are a highly regulated class of membrane proteins that drive the efficient merger of two distinct lipid bilayers into one interconnected structure. This protocol describes our fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based single vesicle-vesicle fusion assays for SNAREs and accessory proteins. Both lipid-mixing (with FRET pairs acting as lipophilic dyes in the membranes) and content-mixing assays (with FRET pairs present on a DNA hairpin that becomes linear via hybridization to a complementary DNA) are described. These assays can be used to detect substages such as docking, hemifusion, and pore expansion and full fusion. The details of flow cell preparation, protein-reconstituted vesicle preparation, data acquisition and analysis are described. These assays can be used to study the roles of various SNARE proteins, accessory proteins and effects of different lipid compositions on specific fusion steps. The total time required to finish one round of this protocol is 3–6 d.
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影响因子：
3.4
作者：
Christensen, Sune M.;Mortensen, Michael W.;Stamou, Dimitrios G.
通讯作者：
Stamou, Dimitrios G.
DOI：
10.1073/pnas.0401779101
发表时间：
2004-05-11
影响因子：
11.1
作者：
Fix, M;Melia, TJ;Simon, SM
通讯作者：
Simon, SM
影响因子：
16.8
作者：
通讯作者：
--
DOI：
10.1021/la901676e
发表时间：
2009-07-07
期刊：
Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids
影响因子：
--
作者：
Diao J;Yoon TY;Su Z;Shin YK;Ha T
通讯作者：
Ha T
影响因子：
3.4
作者：
Smith, Elizabeth A.;Weisshaar, James C.
通讯作者：
Weisshaar, James C.