Expression and purification of 15N- and 13C-isotope labeled 40-residue human Alzheimer's β-amyloid peptide for NMR-based structural analysis.
Expression and purification of 15N- and 13C-isotope labeled 40-residue human Alzheimer's β-amyloid peptide for NMR-based structural analysis.
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DOI：
10.1016/j.pep.2011.05.012
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发表时间：
2011-09
影响因子：
1.6
通讯作者：
Ishii, Yoshitaka
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Long, Fei;Cho, Wonhwa;Ishii, Yoshitaka
阿尔茨海默病 β-淀粉样肽 (Aβ) 的淀粉样原纤维是淀粉样斑块的主要成分，淀粉样蛋白斑是阿尔茨海默病 (AD) 的一个标志。与 AD 发展相关的淀粉样原纤维和其他类型聚集体中 Aβ 的结构特征和功能受到了极大的关注。本报告描述了一种表达和纯化高质量 40 残基 Aβ(1–40)（大脑中最丰富的 Aβ）的有效方案，用于通过 NMR 波谱进行结构研究。在大肠杆菌中，通过因子 Xa 识别位点 (IEGR▼) 连接的谷胱甘肽 S 转移酶 (GST) 标签过表达 Aβ(1–40)，即使具有可溶性 GST 标签，也会导致不溶性包涵体的形成。通过使用 0.5% (w/v) 月桂酰肌氨酸钠作为增溶剂从包涵体中有效回收 GST-Aβ 融合蛋白，并随后使用谷胱甘肽琼脂糖柱通过亲和层析进行纯化，解决了这个问题。通过 Xa 因子酶切去除 GST 标签并通过 HPLC 纯化，从 1 L 细胞培养物中分别产生约 7 mg 和约 1.5 mg 未标记的 Aβ(1–40) 以及均匀的 15N-和/或 13C-蛋白 Aβ(1-40)。未标记和标记 Aβ 的质谱分析以及获得的 15N 标记 Aβ 单体形式的 1H/15N HSQC 溶液 NMR 谱证实了天然 Aβ(1–40) 的表达。电子显微照相和固态核磁共振分析也证实纯化的 Aβ(1–40) 自组装成富含 β-折叠的淀粉样蛋白原纤维。据我们所知，我们的方案在已发布的重组 Aβ(1–40) 样品生产方案中提供了最高的产率，这些样品可针对基于 NMR 的结构分析进行修改。该方案可用于有效制备用于 NMR 实验的 13C 和 15N 标记的其他淀粉样蛋白形成蛋白和肽。
Amyloid fibrils of Alzheimer’s β-amyloid peptide (Aβ) are a primary component of amyloid plaques, a hallmark of Alzheimer’s disease (AD). Enormous attention has been given to the structural features and functions of Aβ in amyloid fibrils and other type of aggregates in associated with development of AD. This report describes an efficient protocol to express and purify high-quality 40-residue Aβ(1–40), the most abundant Aβ in brains, for structural studies by NMR spectroscopy. Over-expression of Aβ(1–40) with glutathione S-transferase (GST) tag connected by a Factor Xa recognition site (IEGR▼) in E. Coli resulted in the formation of insoluble inclusion bodies even with the soluble GST tag. This problem was resolved by efficient recovery of the GST-Aβ fusion protein from the inclusion bodies using 0.5% (w/v) sodium lauroyl sarcosinate as solubilizing agent and subsequent purification by affinity chromatography using a glutathione agarose column. The removal of the GST tag by Factor Xa enzymatic cleavage and purification by HPLC yielded as much as ~7 mg and ~1.5 mg of unlabeled Aβ(1–40) and uniformly 15N- and/or 13C-protein Aβ(1–40) from 1 L of the cell culture, respectively. Mass spectroscopy of unlabeled and labeled Aβ and 1H/15N HSQC solution NMR spectrum of the obtained 15N-labeled Aβ in the monomeric form confirmed the expression of native Aβ(1–40). It was also confirmed by electron micrography and solid-state NMR analysis that the purified Aβ(1–40) self-assembles into β-sheet rich amyloid fibrils. To the best of our knowledge, our protocol offers the highest yields among published protocols for production of recombinant Aβ(1–40) samples that are amendable for an NMR-based structural analysis. The protocol may be applied to efficient preparation of other amyloid-forming proteins and peptides that are 13C- and 15N-labeled for NMR experiments.
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影响因子：
2.7
作者：
He, W;Hanney, B;Chu, V
通讯作者：
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Ishii, Y
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作者：
Chimon, S;Ishii, Y
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DOI：
10.1073/pnas.230315097
发表时间：
2000-11-21
影响因子：
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作者：
Antzutkin, ON;Balbach, JJ;Tycko, R
通讯作者：
Tycko, R
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25
作者：
Cleary, JP;Walsh, DM;Ashe, KH
通讯作者：
Ashe, KH