Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon.
Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon.
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DOI：
10.3791/64136
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发表时间：
2022-07-01
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Lyumkis D
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Aiyer S;Strutzenberg TS;Bowman ME;Noel JP;Lyumkis D
冷冻电子显微镜（cryo-EM）的单粒子分析（SPA）现在是高分辨率结构生物学的主流技术。SPA的结构测定依赖于获得在薄冰层内玻璃化的大分子物体的多个不同视图。理想情况下，均匀分布的随机投影方向的集合将相当于对象的所有可能视图，从而产生以各向同性方向分辨率为特征的重建。然而，在现实中，许多样品遭受优先取向的颗粒粘附到空气-水界面。这导致数据集中的非均匀角取向分布和重建中的非均匀傅立叶空间采样，转化为以各向异性分辨率为特征的地图。倾斜的样品台提供了一个可推广的解决方案，以克服分辨率各向异性凭借改善取向分布的均匀性，从而傅立叶空间采样的各向同性。本协议描述了一个倾斜阶段的自动数据收集策略，使用Leginon，自动图像采集软件。该过程易于实现，不需要任何额外的设备或软件，并且与用于成像生物大分子的大多数标准透射电子显微镜（TEM）兼容。
Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure determination by SPA relies upon obtaining multiple distinct views of a macromolecular object vitrified within a thin layer of ice. Ideally, a collection of uniformly distributed random projection orientations would amount to all possible views of the object, giving rise to reconstructions characterized by isotropic directional resolution. However, in reality, many samples suffer from preferentially oriented particles adhering to the air-water interface. This leads to non-uniform angular orientation distributions in the dataset and inhomogeneous Fourier-space sampling in the reconstruction, translating into maps characterized by anisotropic resolution. Tilting the specimen stage provides a generalizable solution to overcoming resolution anisotropy by virtue of improving the uniformity of orientation distributions, and thus the isotropy of Fourier space sampling. The present protocol describes a tilted-stage automated data collection strategy using Leginon, a software for automated image acquisition. The procedure is simple to implement, does not require any additional equipment or software, and is compatible with most standard transmission electron microscopes (TEMs) used for imaging biological macromolecules.
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