Indo-1 derivatives for local calcium sensing.
Indo-1 derivatives for local calcium sensing.
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DOI：
10.1021/cb800258g
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发表时间：
2009-03-20
影响因子：
4
通讯作者：
Johnsson, Kai
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bannwarth, Michael;Correa, Ivan R., Jr.;Sztretye, Monika;Pouvreau, Sandrine;Fellay, Cindy;Aebischer, Annina;Royer, Leandro;Ríos, Eduardo;Johnsson, Kai
钙在信号转导中的作用依赖于对其浓度的精确空间和时间控制。现有的以足够的时间和空间分辨率检测 Ca2+ 浓度波动的方法是有限的。我们在此介绍一种测量活细胞中指定位置 Ca2+ 浓度的方法，该方法基于将 Ca2+ 敏感染料 Indo-1 与 SNAP 标签融合蛋白的连接。 SNAP-Indo-1 缀合物的体外荧光光谱表明，该缀合物保留了 Indo-1 的 Ca2+ 感应能力。在原理验证实验中，在表达细胞核定位 SNAP 标签融合的小鼠培养原代肌细胞中证明了局部 Ca2+ 感应。通过荧光共焦显微图像的 SEER（激发和发射比位移）测量静息细胞核内的 Ca2+ 浓度。质膜透化后，沐浴溶液的变化引起核 [Ca2+] 的相应变化，这些变化很容易检测到并用于该技术的初步校准。因此，这项工作展示了基于 SNAP 标签的 Ca2+ 指示剂的合成和应用，该指示剂将基因编码的钙指示剂的空间特异性与合成指示剂的有利光谱特性结合起来。
The role of calcium in signal transduction relies on the precise spatial and temporal control of its concentration. The existing means to detect fluctuations in Ca2+ concentrations with adequate temporal and spatial resolution are limited. We introduce here a method to measure Ca2+ concentrations in defined locations in living cells that is based on linking the Ca2+-sensitive dye Indo-1 to SNAP-tag fusion proteins. Fluorescence spectroscopy of SNAP-Indo-1 conjugates in vitro showed that the conjugates retained the Ca2+-sensing ability of Indo-1. In a proof-of-principle experiment, local Ca2+ sensing was demonstrated in cultured primary muscle cells of mice expressing a nucleus-localized SNAP-tag fusion. Ca2+ concentrations inside nuclei of resting cells were measured by SEER (shifted excitation and emission ratioing) of confocal microscopic images of fluorescence. After permeabilizing the plasma membrane, changes in the bathing solution induced corresponding changes in nuclear [Ca2+] that were readily detected and used for a preliminary calibration of the technique. This work thus demonstrates the synthesis and application of SNAP-tag-based Ca2+ indicators that combine the spatial specificity of genetically encoded calcium indicators with the advantageous spectroscopic properties of synthetic indicators.
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