Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling
Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling
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DOI：
10.1002/pmic.201000472
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发表时间：
2011-01-01
期刊：
影响因子：
3.4
通讯作者：
Kinoshita-Kikuta, Emiko
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kinoshita, Eiji;Kinoshita-Kikuta, Emiko
我们描述了一种改进的磷酸化蛋白质标签十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Zn(2 +)-磷酸化蛋白质标签十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳），它使用磷酸化蛋白质标签丙烯酰胺的二锌(II)配合物，并结合双 - 三（羟甲基）氨基甲烷缓冲的中性pH凝胶体系来检测磷蛋白迁移率的变化。现有的一种技术（Mn(2 +)-磷酸化蛋白质标签十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳）使用结合在聚丙烯酰胺上的Mn(2 +)-磷酸化蛋白质标签以及在碱性pH条件下的常规莱姆利缓冲体系，在分离某些磷蛋白方面存在局限性。通过对市售胃蛋白酶、在体外经酪氨酸激酶处理的重组陶蛋白以及全细胞裂解物中的内源性β - 连环蛋白出现的新的向上迁移条带进行可视化，展示了主要的改进之处。此外，Zn(2 +)-磷酸化蛋白质标签十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶比Mn(2 +)-磷酸化蛋白质标签十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶表现出更好的长期稳定性。因此，我们能够为磷酸亲和性十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳提供一种简单、方便且更可靠的自制凝胶体系。
We describe an improved Phos-tag SDS-PAGE (Zn(2+)-Phos-tag SDS-PAGE) using a dizinc(II) complex of Phos-tag acrylamide in conjunction with a Bis-tris-buffered neutral-pH gel system to detect shifts in the mobility of phosphoproteins. An existing technique (Mn(2+)-Phos-tag SDS-PAGE) using a polyacrylamide-bound Mn(2+)-Phos-tag and a conventional Laemmli's buffer system under alkaline pH conditions has limitations for separating certain phosphoproteins. The major improvements were demonstrated by visualizing novel up-shifted bands of commercially available pepsin, recombinant Tau treated in vitro with tyrosine kinases, and endogeneous beta-catenin in whole-cell lysates. Additionally, the Zn(2+)-Phos-tag SDS-PAGE gels showed better long-term stability than the Mn(2+)-Phos-tag SDS-PAGE gels. We can therefore provide a simple, convenient, and more reliable homemade gel system for phosphate-affinity SDS-PAGE.