Sorting cells for basal and induced autophagic flux by quantitative ratiometric flow cytometry.
Sorting cells for basal and induced autophagic flux by quantitative ratiometric flow cytometry.
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DOI：
10.4161/auto.29394
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发表时间：
2014-07
期刊：
影响因子：
13.3
通讯作者：
Thorburn A
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gump JM;Thorburn A
我们在这里详细介绍了一种使用串联标记的mCherry-EGFP-LC 3（C-G-LC 3）的方案，通过比率流式细胞术定量单个细胞中的自噬通量，并根据自噬通量的相对水平分离细胞亚群。这种强大而灵敏的方法测量自噬通量而不是自噬体数量，是自噬研究人员测量自噬的一系列工具的重要补充。该方案中的两个关键步骤是i）产生组成型表达C-G-LC 3的细胞，其具有低至中等荧光和低荧光可变性，以及ii）在适当配备的流式细胞仪上正确设置门和电压/增益。我们已经使用这种方法来测量各种细胞类型和实验系统中使用许多不同的自噬刺激的自噬通量。在分选流式细胞仪上，该技术可用于分离具有不同水平的基础自噬通量的细胞，或响应于给定刺激而具有可变通量诱导的细胞，用于进一步分析或实验。我们还将自噬通量的定量与测量细胞凋亡和细胞表面蛋白的方法相结合，证明了该方案与其他流式细胞术标记和标志物相结合的有用性。
We detail here a protocol using tandem-tagged mCherry-EGFP-LC3 (C-G-LC3) to quantify autophagic flux in single cells by ratiometric flow cytometry and to isolate subpopulations of cells based on their relative levels of autophagic flux. This robust and sensitive method measures autophagic flux rather than autophagosome number and is an important addition to the autophagy researcher’s array of tools for measuring autophagy. Two crucial steps in this protocol are i) generate cells constitutively expressing C-G-LC3 with low to medium fluorescence and low fluorescence variability, and ii) correctly set up gates and voltage/gain on a properly equipped flow cytometer. We have used this method to measure autophagic flux in a variety of cell types and experimental systems using many different autophagy stimuli. On a sorting flow cytometer, this technique can be used to isolate cells with different levels of basal autophagic flux, or cells with variable induction of flux in response to a given stimulus for further analysis or experimentation. We have also combined quantification of autophagic flux with methods to measure apoptosis and cell surface proteins, demonstrating the usefulness of this protocol in combination with other flow cytometry labels and markers.
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