A mammalian cell-based assay for screening inhibitors of RNA cleavage.
A mammalian cell-based assay for screening inhibitors of RNA cleavage.
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一种基于哺乳动物细胞的检测方法，用于筛选 RNA 切割抑制剂。
DOI：
10.1007/978-1-59745-558-9_24
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发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Mulligan,RichardC
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Yen,Laising;Stockwell,BrentR;Mulligan,RichardC
RNA切割是一种催化反应，它定义了许多类型的RNA加工事件，包括代谢物敏感核糖开关、自剪接内含子、mRNA剪接、tRNA加工、polyA切割和各种小核酶如发夹和锤头状核酶。在这一章中，我们描述了一个通用的方法，用于开发一个哺乳动物细胞为基础的高通量筛选试验，用于识别能够抑制哺乳动物细胞中的RNA裂解的小分子。在所述的特异性测定中，将其中荧光素酶报告基因的表达受锤头状核酶切割控制的质粒DNA载体稳定地引入人293细胞系中。这样的细胞系使得能够快速筛选化合物文库和鉴定能够阻断核酶切割的细胞膜可渗透的抑制性分子。稍后描述的一般策略原则上可以适用于鉴定许多类型的RNA切割反应的小分子抑制剂。
RNA cleavage is a catalytic reaction which defines many types of RNA processing events, including those of metabolite-sensing riboswitch, self-splicing introns, mRNA splicing, tRNA processing, polyA-cleavage, and various small ribozymes such as hairpin and hammerhead ribozyme. In this chapter, we describe a general methodology for developing a mammalian cell-based high-throughput screening assay useful for identifying small molecules capable of inhibiting RNA cleavage in mammalian cells. In the specific assay described, a plasmid DNA vector in which the expression of a luciferase reporter gene is controlled by hammerhead ribozyme cleavage was stably introduced into the human 293 cell line. Such a cell line enabled the rapid screening of chemical compound libraries and the identification of cell membrane-permeable inhibitory molecules capable of blocking ribozyme cleavage. The general strategy described later could in principle be adapted to identify small molecule inhibitors of many types of RNA cleavage reactions.
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