Search for the acetylcholine and vesamicol binding sites in vesicular acetylcholine transporter: the region around the lumenal end of the transport channel.
Search for the acetylcholine and vesamicol binding sites in vesicular acetylcholine transporter: the region around the lumenal end of the transport channel.
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DOI：
10.1111/j.1471-4159.2010.06990.x
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发表时间：
2010-11
影响因子：
4.7
通讯作者：
Parsons SM
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Khare P;Mulakaluri A;Parsons SM
囊泡乙酰胆碱转运蛋白（VAChT；TC 2.A.1.2.13）介导突触囊泡对乙酰胆碱（ACh）的储存。 VAChT 的三维同源模型是可用的，但 ACh 和变构抑制剂 vesamicol 的结合位点尚不清楚。在之前的工作中，大鼠 VAChT 跨膜螺旋 VIII (TM VIII) 管腔起始处的不变 W331 突变导致对 ACh 的平衡亲和力损失多达 9 倍，但对维萨考特的亲和力没有损失。目前的工作研究了 W331 内部和周围以及底物运输通道附近的腔端的额外突变的影响。人 VAChT 突变体在 PC12A123.7 细胞系中表达，并使用放射性标记配体和结合和转运过滤测定进行表征。 W331 中的新突变和重复突变的特性与原始观察结果一致。其他 13 个残基中的 16 个附加突变（Y60 位于管腔环 I/II 的开头，F231 位于 TM V 的管腔末端，W315、M316、K317 位于 TM VII 的管腔末端，M320、A321、W325、A330 位于管腔环 VII/VIII 中，A334 位于管腔环 VII/VIII 的管腔末端TM VIII 和 TM X 管腔起始处的 C388、C391、F392），仅 A334F 会损害结合。该突变使 ACh 和 vesamicol 平衡结合亲和力分别降低 14 倍和 4 倍。目前的结果与之前的结果相结合，证明了靠近囊泡腔的残基空间簇的存在，当该簇突变时，该残基会降低对乙酰胆碱和/或维沙考的亲和力。该簇由 TM VIII 中的不变 W331、高度保守的 A334 和不变 F335 以及 TM X 中的不变 C391 组成。讨论了 ACh 和维沙考结合位点相对于该簇的位置的不同模型。
Vesicular acetylcholine transporter (VAChT; TC 2.A.1.2.13) mediates storage of acetylcholine (ACh) by synaptic vesicles. A three-dimensional homology model of VAChT is available, but the binding sites for ACh and the allosteric inhibitor vesamicol are unknown. In previous work, mutations of invariant W331 in the lumenal beginning of transmembrane helix VIII (TM VIII) of rat VAChT led to as much as 9-fold loss in equilibrium affinity for ACh and no loss in affinity for vesamicol. The current work investigates the effects of additional mutations in and around W331 and the nearby lumenal end of the substrate transport channel. Mutants of human VAChT were expressed in the PC12A123.7 cell line and characterized using radiolabeled ligands and filtration assays for binding and transport. Properties of a new and a repeat mutation in W331 are consistent with the original observations. Of sixteen additional mutations in thirteen other residues (Y60 in the beginning of lumenal Loop I/II, F231 in the lumenal end of TM V, W315, M316, K317, in the lumenal end of TM VII, M320, A321, W325, A330 in lumenal Loop VII/VIII, A334 in the lumenal beginning of TM VIII, and C388, C391, F392 in the lumenal beginning of TM X), only A334F impairs binding. This mutation decreases ACh and vesamicol equilibrium binding affinities by 14- and 4-fold, respectively. The current results, combined with previous results, demonstrate existence of a spatial cluster of residues close to vesicular lumen that decreases affinity for ACh and/or vesamicol when the cluster is mutated. The cluster is composed of invariant W331, highly conserved A334, and invariant F335 in TM VIII and invariant C391 in TM X. Different models for the locations of the ACh and vesamicol binding sites relative to this cluster are discussed.
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