Analyzing the topology of N-linked glycans by PNGase F accessibility assay.
Analyzing the topology of N-linked glycans by PNGase F accessibility assay.
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DOI：
10.1016/j.xpro.2023.102458
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发表时间：
2023-09-15
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Ye, Jin
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Wang, Jingcheng;Ye, Jin
虽然N-葡聚糖是在管腔中合成的，但其中一些通过与内质网相关的降解无关的逆转位到达细胞膜的胞液侧。在这里，我们提出了一种方法来测量跨膜蛋白中N-糖链的拓扑结构，其原理是在没有洗涤剂的情况下，胞质N-糖链被PNGase F修剪而不是管腔N-糖链被修剪。我们描述了这个方案的程序，包括从细胞中制备微生物体，PNGase F可及性分析，和蛋白质印迹分析。关于本协议的使用和执行的完整细节，请参考Wang等人。鉴定细胞内细胞器蛋白质N-糖链定位的方案制备微粒子的步骤和执行PNGase F可及性分析以测量微粒子中蛋白质的脱糖基化的步骤出版者注：进行任何实验方案都需要遵守当地实验室安全和伦理的机构指南。虽然N-葡聚糖是在管腔中合成的，但其中一些通过与内质网相关的降解无关的逆转位到达细胞膜的胞液侧。在这里，我们提出了一种方法来测量跨膜蛋白中N-糖链的拓扑结构，其原理是在没有洗涤剂的情况下，胞质N-糖链被PNGase F修剪而不是管腔N-糖链被修剪。我们描述了这个方案的程序，包括从细胞中制备微生物体，PNGase F可及性分析，和蛋白质印迹分析。
While N-glycans are synthesized in the lumens, some of them reach the cytosolic side of membranes through retro-translocation independent of endoplasmic-reticulum-associated degradation. Here, we present a protocol to measure the topology of N-glycans in a transmembrane protein, based on the principle that cytosolic but not luminal N-glycans are trimmed by PNGase F in the absence of detergent. We describe the procedures for this protocol consisting of microsome preparation from cells, PNGase F accessibility assay, and western blot analysis. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Wang et al. Protocol for identifying localization of N-glycans on intracellular organelle proteins Steps for preparing microsomes and performing PNGase F accessibility assay Assay to measure the deglycosylation of proteins in microsomes Publisher’s note: Undertaking any experimental protocol requires adherence to local institutional guidelines for laboratory safety and ethics. While N-glycans are synthesized in the lumens, some of them reach the cytosolic side of membranes through retro-translocation independent of endoplasmic-reticulum-associated degradation. Here, we present a protocol to measure the topology of N-glycans in a transmembrane protein, based on the principle that cytosolic but not luminal N-glycans are trimmed by PNGase F in the absence of detergent. We describe the procedures for this protocol consisting of microsome preparation from cells, PNGase F accessibility assay, and western blot analysis.
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