Stable Cu(II) and Cu(I) mononuclear intermediates in the assembly of the CuA center of Thermus thermophilus cytochrome oxidase.
Stable Cu(II) and Cu(I) mononuclear intermediates in the assembly of the CuA center of Thermus thermophilus cytochrome oxidase.
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DOI：
10.1021/ja307276z
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发表时间：
2012-10-03
影响因子：
15
通讯作者：
Blackburn NJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chacón KN;Blackburn NJ
CuA 是一个双核混合价中心，位于嗜热栖热菌 ba3 型细胞色素氧化酶的 2 亚基中。该位点在周质膜内的组装被认为是由铜伴侣Sco和/或PCuAC介导的，但其生物学机制仍知之甚少，从而激发了人们对无机离子形成CuA机制的兴趣。 CuA 中心的公式为电子离域 Cu1.5 – Cu1.5 系统，暗示金属化过程中的 Cu(II) 和 Cu(I) 态。在早期的工作中，我们表明，配位 M160 残基的硒代蛋氨酸 (SeM) 取代提供了一种配体导向探针，用于通过 Se XAS 信号研究铜配位环境，这对于询问其他光谱探针不存在的 Cu(I) 态特别有用。在本研究中，我们通过停流 UV-vis、EPR 和 XAS 在 Cu 和 Se 边缘研究了混合价 CuA 及其 M160SeM 衍生物的形成，而仅通过 XAS 研究了完全还原的二铜（I）CuA 的形成。我们的结果证实了以前未检测到的单核中间体的存在，并显示出与紫色 CuA 天青蛋白的金属化反应的重要差异。 Cu 和 Se 边缘的 XAS 光谱使我们能够将机械推论扩展到 di-Cu(I) 态的形成，这可能与生物 CuA 组装更相关。特别是，我们发现嗜热嗜热菌 CuA 的组装速度比报道的其他 CuA 系统更快，并且混合价途径中的主要中间体是一种新的绿色物种，其 λmax = 460 nm。该中间体以均质状态被分离，并显示为单核 Cu(II)-(His)(Cys)2 物质，没有可观察到的 Cu(II)-(Met) 相互作用。用连二亚硫酸盐还原生成其 Cu(I) 同系物，该同系物同样是单核的，但现在显示出与 Met160 硫醚的强烈相互作用。结果在以下框架内进行了讨论：(i) Cu(II) 硫醇盐的“耦合畸变”模型，以及 (ii) 它们与 CuA 中心生物金属化反应的相关性。
CuA is a dinuclear mixed-valence center located in subunit 2 of the ba3 type cytochrome oxidase from Thermus thermophilus. The assembly of this site within the periplasmic membrane is believed to be mediated by the copper chaperones Sco and/or PCuAC, but the biological mechanisms are still poorly understood, thereby stimulating interest in the mechanisms of CuA formation from inorganic ions. The formulation of the CuA center as an electron-delocalized Cu1.5 – Cu1.5 system, implicates both Cu(II) and Cu(I) states in the metalation process. In earlier work we showed that selenomethionine (SeM) substitution of the coordinated M160 residue provided a ligand-directed probe for studying the copper coordination environment via the Se XAS signal, which was particularly useful for interrogating the Cu(I) states where other spectroscopic probes are absent. In the present study we have investigated the formation of mixed-valence CuA and its M160SeM derivative by stopped-flow UV-vis, EPR, and XAS at both Cu and Se edges, while the formation of fully reduced di-Cu(I) CuA has been studied by XAS alone. Our results establish the presence of previously undetected mononuclear intermediates, and show important differences from the metalation reactions of purple CuA azurin. XAS spectroscopy at Cu and Se edges has allowed us to extend mechanistic inferences to formation of the di-Cu(I) state which may be more relevant to biological CuA assembly. In particular, we find that T. thermophilus CuA assembles more rapidly than reported for other CuA systems, and that the dominant intermediate along the pathway to mixed-valence is a new green species with λmax = 460 nm. This intermediate has been isolated in a homogeneous state, and shown to be a mononuclear Cu(II)-(His)(Cys)2 species with no observable Cu(II)-(Met) interaction. Reduction with dithionite generates its Cu(I) homologue which is again mononuclear, but now shows a strong interaction with the Met160 thioether. The results are discussed within the framework of (i) the “coupled distortion” model for Cu(II) thiolates, and (ii) their relevance to biological metalation reactions of the CuA center.
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