Top-down/Bottom-up Mass Spectrometry Workflow Using Dissolvable Polyacrylamide Gels.
Top-down/Bottom-up Mass Spectrometry Workflow Using Dissolvable Polyacrylamide Gels.
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DOI：
10.1021/acs.analchem.7b00357
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发表时间：
2017-08-15
影响因子：
7.4
通讯作者：
Loo JA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Takemori N;Takemori A;Wongkongkathep P;Nshanian M;Loo RRO;Lermyte F;Loo JA
生物学家用于分离、分析和可视化蛋白质的卓越工具箱是SDS-PAGE，然而将嵌入这些聚丙烯酰胺介质中的蛋白质作为完整物种回收是质谱法的一个长期挑战。在传统的工作流程中，来自粗制生物样品的蛋白质混合物在N，N′-亚甲基双丙烯酰胺交联聚丙烯酰胺凝胶中以高分辨率进行色谱分离，以降低样品复杂性并促进灵敏的表征。然而，低蛋白质回收率，特别是对于高分子量蛋白质，经常阻碍质谱法的表征。我们描述了一个自上而下/自下而上质谱分析的蛋白质在聚丙烯酰胺平板凝胶使用可溶性，双丙烯酰胱胺交联聚丙烯酰胺，使高分辨率的蛋白质分离，同时回收完整的蛋白质在广泛的大小范围内有效的工作流程。如粗组织提取物的SDS-PAGE所示，长期以来与可还原凝胶相关的电泳分辨率较低的问题已经克服。该工作流程可有效洗脱完整蛋白质，支持生物学家首选分离平台上解析的蛋白质的MS和MS/MS。
Biologists’ preeminent toolbox for separating, analyzing, and visualizing proteins is SDS-PAGE, yet recovering the proteins embedded in these polyacrylamide media as intact species is a long-standing challenge for mass spectrometry. In conventional workflows, protein mixtures from crude biological samples are electrophoretically separated at high-resolution within N,N′-methylene-bis-acrylamide crosslinked polyacrylamide gels to reduce sample complexity and facilitate sensitive characterization. However, low protein recoveries, especially for high molecular weight proteins, often hinder characterization by mass spectrometry. We describe a workflow for top-down/bottom-up mass spectrometric analyses of proteins in polyacrylamide slab gels using dissolvable, bis-acryloylcystamine-crosslinked polyacrylamide, enabling high-resolution protein separations while recovering intact proteins over a broad size range efficiently. The inferior electrophoretic resolution long associated with reducible gels has been overcome, as demonstrated by SDS-PAGE of crude tissue extracts. This workflow elutes intact proteins efficiently, supporting MS and MS/MS from proteins resolved on biologists’ preferred separation platform.
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DOI：
10.1007/s13361-014-0928-6
发表时间：
2014-12
影响因子：
3.2
作者：
Li, Huilin;Wongkongkathep, Piriya;Van Orden, Steve L.;Loo, Rachel R. Ogorzalek;Loo, Joseph A.
通讯作者：
Loo, Joseph A.
影响因子：
2.9
作者：
HANSEN, JN
通讯作者：
HANSEN, JN
DOI：
10.1007/s13361-015-1286-8
发表时间：
2016-02-01
影响因子：
3.2
作者：
Yu, Deyang;Peng, Ying;Ge, Ying
通讯作者：
Ge, Ying
影响因子：
2.9
作者：
GHAFFARI, SH;DUMBAR, TS;OLSON, MOJ
通讯作者：
OLSON, MOJ
影响因子：
64.8
作者：
Tran, John C.;Zamdborg, Leonid;Ahlf, Dorothy R.;Lee, Ji Eun;Catherman, Adam D.;Durbin, Kenneth R.;Tipton, Jeremiah D.;Vellaichamy, Adaikkalam;Kellie, John F.;Li, Mingxi;Wu, Cong;Sweet, Steve M. M.;Early, Bryan P.;Siuti, Nertila;LeDuc, Richard D.;Compton, Philip D.;Thomas, Paul M.;Kelleher, Neil L.
通讯作者：
Kelleher, Neil L.