DNA複製と共役する姉妹染色分体間接着機構の一分子動態理解

すべての真核生物において、複製されたDNA同士はかならず接着される。この姉妹染色分体間接着における原則は、真核生物のゲノム均等分配を支える基本原則でありながら、その分子メカニズムが明らかになっていない。本研究では、接着確立因子Sororinの複製依存的なローディング機構と、接着を担うコヒーシン複合体の構造変化に着目し、細胞生物学、生化学的手法と一分子解析手法を組み合わせることにより、DNA複製依存的に確立される接着機構の全容を一分子レベルで理解することを目指す。 本年度はSororinローディング機構の解明の準備に取り組んだ。ヒトSororin－GFPを恒常的に発現するヒトHeLa細胞およびショウジョウバエDalmatian-GFP発現ショウジョウバエS2細胞の作製を行った。アフリカツメガエル卵抽出液からのSororin-GFPタンパク質を用いたプルダウンアッセイを行った結果、複製因子C（Replication Factor C）複合体をはじめ、Sororin結合因子が複数同定された。すでにSororinとの結合が報告されているコヒーシン複合体サブユニットも複数検出されたことから、プルダウン系は正しく機能していると考えられるが、ツメガエル卵抽出液では核／細胞質比が体細胞と大きく異なるため、DNA複製に関わる因子の濃度も低く、DNA複製期に接着を確立することが示唆されているSororinの機能を正しく解釈できない可能性が危惧された。そのため、核／細胞質比を増加させた実験系で検証を行う必要性が示唆された。

すべての真核生物において、複製されたDNA同士はかならず接着される。この姉妹染色分体間接着における原則は、真核生物のゲノム均等分配を支える基本原則でありながら、その分子メカニズムが明らかになっていない。本研究では、接着確立因子Sororinの複製依存的なローディング機構と、接着を担うコヒーシン複合体の構造変化に着目し、細胞生物学、生化学的手法と一分子解析手法を組み合わせることにより、DNA複製依存的に確立される接着機構の全容を一分子レベルで理解することを目指す。 本年度はSororinローディング機構の解明の準備に取り組んだ。ヒトSororin－GFPを恒常的に発現するヒトHeLa細胞およびショウジョウバエDalmatian-GFP発現ショウジョウバエS2細胞の作製を行った。アフリカツメガエル卵抽出液からのSororin-GFPタンパク質を用いたプルダウンアッセイを行った結果、複製因子C（Replication Factor C）複合体をはじめ、Sororin結合因子が複数同定された。すでにSororinとの結合が報告されているコヒーシン複合体サブユニットも複数検出されたことから、プルダウン系は正しく機能していると考えられるが、ツメガエル卵抽出液では核／細胞質比が体細胞と大きく異なるため、DNA複製に関わる因子の濃度も低く、DNA複製期に接着を確立することが示唆されているSororinの機能を正しく解釈できない可能性が危惧された。そのため、核／細胞質比を増加させた実験系で検証を行う必要性が示唆された。