新規人工酵素・基質ペアの構築によるシステインパースルフィド産生システムの開発

通过构建新型人工酶-底物对开发半胱氨酸过硫化物生产系统

• 批准号: 21J13963
• 负责人: 越膳 ほなみ
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J13963/
• 关键词: 阻害剤スクリーニング; 蛍光プローブ

本研究では、生体内に存在し高い反応性を示すcysteine persulfide（CysSSH）の産生酵素であるcystathionine γ-lyase（CSE）及びcystathionine β-synthase（CBS）に着目し、CysSSHの産生及び産生阻害を行うツールの開発に取り組んだ。今年度の取り組みにおいて、CBSの機能の阻害を行うツールとして新規CBS阻害剤の開発研究が進展したため、その内容を報告する。具体的には、まずスクリーニングにおいて高感度にCBSの酵素活性を検出可能な蛍光プローブの開発に成功した。次に、開発した新規蛍光プローブを用いてプレートリーダーによりCBSの酵素活性を検出し、阻害剤スクリーニングに取り組んだ。大腸菌により発現・精製したCBSを用いて、東京大学創薬機構が所有する32,000化合物に対する阻害剤スクリーニングを行ったところ、ヒット化合物を得ることに成功した。更にスクリーニングにより得られたヒット化合物の詳細な性質の解析を行った結果、開発した新規阻害剤は他の活性イオウ分子産生酵素であるCSEや3-mercaptopyruvate sulfurtransferase（3MST）に対しては阻害活性を示さず、CBS選択的な阻害剤であることが分かった。更に精製酵素だけでなく、CBSを過剰発現させたHEK293T細胞の細胞ライセートに対する阻害活性も評価したところ、新規阻害剤は細胞夾雑物の存在下においても阻害活性を示すことが分かった。

In this study, cystatin γ-lyase (CSE) and cystatin β-synthase (CBS), which are highly reactive enzymes, were identified in vivo. This year's selection process, CBS function resistance and implementation of new CBS resistance and development research progress, and the content of the report The enzyme activity of CBS was detected successfully in the development of light source. In addition, the development of new light sources in the use of chemical reagents, such as CBS enzyme activity detection, inhibition of chemical reagents, selection of chemical reagents. Coliform discovery, purification, and use of all 32,000 compounds from the University of Tokyo's Creative Institute were successful. The results of the analysis of the detailed properties of the compounds showed that CSE and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3MST) were the most effective inhibitors of the compounds. Further, the purified enzyme, CBS, was detected in HEK293T cells. The inhibition activity of HEK293T cells was evaluated in the presence of a new inhibitor.