新規Z型テルペン生合成酵素群の発掘による新規生理活性物質の発見

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本研究では、報告例がごく僅かであるZ型テルペン生合成酵素の発見から、新規生理活性物質の発掘への展開を目指す。申請者らは、既知酵素との類似性のない新型の「Z型環化酵素」と、Z型二重結合を還元する初めての酵素である「Z型還元酵素」を抗酸菌から見出しており、両酵素の同定を第一の目標とする。加えて、結晶構造や変異導入実験を行い、立体構造や活性部位モチーフを明らかにする。その後、Z型環化・還元酵素を基にゲノムマイニングを行い、新規性の高いテルペンを数多く見出す。見出された新規テルペンについては生理活性を解析し、有用なテルペンを新たに発見する。これによって、「生合成的に新規性の高い天然物の探索→新規性の高い酵素の発見→新規生理活性物質の発見」の流れの有効性を示す。昨年度同定した「Z型還元酵素」について、大腸菌組換え酵素や抗酸菌発現系を用いた基質特異性や諸性質の解析を進めたところ、本酵素がZ,E混成型イソプレノイドのZ型だけでなくE型の二重結合も還元する初めての酵素であることを明らかにできた。また、ホモログ酵素の解析から、Z型二重結合のみを特異的に還元する酵素の同定に成功したことも成果のひとつである。「Z型環化酵素」の探索に関しては、当初計画していたショットガンクローニングが難航したため、方針を転換し、硫安沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどによってネイティブな酵素精製を進めた。部分精製画分が得られたため、これをLC-MS/MSによって解析し、4種の候補タンパク質を見出すことができた。これらの候補遺伝子を大腸菌や抗酸菌発現ベクターにクローニングし、現在、酵素活性の解析を進めている。