Structural analysis of target proteins based on multifunctional photoaffinity labeling

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本研究では、多機能を集積した独自の小型光反応基を改良し、生理活性リガンドのターゲットタンパク質同定効率を向上しつつ、従来法では困難であったリガンド結合ドメインにおける複数ラベル部位同定を達成する。それらラベルアミノ酸残基の位置情報にラベル量情報を加えることで、リガンド相互作用状態の微細な構造変化を追跡し評価し得る、新たな光アフィニティーラベル法（PAL）への展開を図る。初年度、o-ヒドロキシ桂皮酸を母核とし、ジアジリン基導入位置をベンゼン環からアルキル鎖にした新たな発蛍光性光クロスリンカーを開発した。このクロスリンカーを導入したリガンドプローブによるPALでは、従来型に比較してラベル収率が大幅に向上し、さらに酵素活性中心近傍をラベルすることが明らかとなり、ジアジリン基部分の大きさや柔軟性がタンパク質のリガンド相互作用部位ラベルにおいて重要な要因であることが示された。しかし、アルキルジアジリン由来の多様な副反応によりMS解析が極めて複雑化し、大部分のラベル部位が同定困難であった。それら副反応を抑えるため、２年目では新たにトリフルオロメチル置換型アルキルジアジリン誘導体開発に取り組んだ結果、複数の誘導体を合成することに成功した。一方、極微量ラベルタンパク質、および複数ラベル部位解析の効率化を目的とした銅触媒アジド－アルキン環化付加反応（CuAAC）の高速化法の開発では、まずアジド基導入ペプチド銅配位子を最適化した。別途、PALでアルキニル化したタンパク質を調整し、これを用いてCuAACを検討したところ、タンパク質の系においても汎用銅配位子TBTAに比べ、収率と反応速度の大幅な向上が確認できた。