Molecular basis and functional modulation of carbohydrate epimerases and isomerases useful for carbohydrate conversion

用于碳水化合物转化的碳水化合物差向异构酶和异构酶的分子基础和功能调节

• 批准号: 21K05388
• 负责人: 佐分利 亘
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05388/
• 关键词: マンノース2-エピメラーゼ; セロビオース2-エピメラーゼ; オリゴ糖; 糖質; 異性化; キメラ酵素; エピメラーゼ; イソメラーゼ

糖質の高度利用には，希少糖質の効率合成法が必要である.本研究ではセロビオース2-エピメラーゼ (CE酵素) や マンノースイソメラーゼなど様々な糖質異性化酵素を含む酵素群の反応特異性を制御する機構の解明と高活性変異酵素の開発を目的とした.エピメラーゼ活性のみを示すCE (1機能CE酵素) とエピメラーゼ活性とイソメラーゼ活性を示す2機能CE酵素の間で構造領域を入れ換えた一連のキメラ酵素のうち，(α/ α)6バレル触媒ドメインを構成するα-ヘリックス1と2，3と4，5と6を入れ替えたキメラ酵素の機能を解析した．Glcβ-4ManとGlcβ-4Fruに対する初速度に基づき2機能CE酵素に1機能CE酵素のα-ヘリックス1と2，3と4を入れ換えたキメラ酵素は野生型2機能酵素よりも低いイソメラーゼ特異性を示した.すなわち，α-ヘリックス１から4に至る領域がイソメラーゼ反応に重要な構造を含むことが示唆された．マンノースエピメラーゼ (ME酵素) については高活性変異酵素のハイスループットスクリーニング系の評価を行った．ME酵素をマンノース取り込み能を欠失させた大腸菌の細胞表層に発現させたところ，この細胞懸濁液中でのManの減少を確認した．すなわち，マンノースは菌体外ME酵素によるグルコースへの異性化を介して菌体に取り込まれたと理解された．またこの大腸菌形質転換体はマンノースを唯一の炭素源として生育した．組換えME酵素のC末端側にGFPタンパク質を融合し，菌体表層中のME酵素の簡便な定量方法を構築した．ランダム変異を導入したME変異酵素ライブラリーをグルコースとマンノースを唯一の炭素源とする培地で生育させるとマンノース培地でのコロニー数はグルコース培地でのコロニー数の5%程度であり，低活性変異酵素はマンノース培地で生育できずに除外されることが示唆された．

High utilization of sugar, less sugar efficiency synthesis method is necessary. The purpose of this study is to elucidate the mechanism for the development of highly active isoenzymes by controlling the specificity of glucosyl-isoenzymes, including enzyme groups. CE (1 Function CE Enzyme) 5. 6. 7. 8. 9. The structure of the structure. The development of E. coli cell surface layer and the reduction of Man in cell suspension were confirmed. In vitro ME enzymes are used to isolate and differentiate bacteria. This is the only source of carbon in the form of Escherichia coli. Construction of a simple quantitative method for ME enzyme in the surface layer of bacteria by fusion of GFP protein on the C-terminal side of ME enzyme. In addition to the low activity of the enzyme, the number of enzymes in the culture medium is 5% of the number of enzymes in the culture medium.

项目成果

北海道大学大学院農学研究院生物化学研究室ホームページ

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Expansion of enzymatic synthesis of carbohydrates using novel carbohydrate-active enzymes

使用新型碳水化合物活性酶扩展碳水化合物的酶促合成

• 发表时间: 2022
• 作者: 原田美帆;難波純也;丸田 隆典;石川孝博;吉村和也;重岡 成;小川貴央;大澤陽，黒原崇，村上優貴，柴田識人，内藤幹彦，出水庸介;村上優貴，石田祥一，出水庸介，寺山慧;鵜飼亮伍，中川千春，上村葉月，深津萌々花，橋本美涼，海老原章郎，中川寅;Wataru Saburi
• 通讯作者: Wataru Saburi

セロビオース2-エピメラーゼが持つイソメラーゼ活性に重要な構造の解析

对异构酶活性重要的纤维二糖 2-差向异构酶的结构分析

• 发表时间: 2022
• 作者: 杉井天真;原田美帆;丸田隆典;石川孝博;吉村和也;重岡 成;小川貴央;佐分利 亘，森 春英
• 通讯作者: 佐分利 亘，森 春英

Runella slithyformis由来マンノース2-エピメラーゼ (RsME) の高活性化を指向したスクリーニング

筛选高活化性的石螈源性甘露糖 2-差向异构酶 (RsME)

• 发表时间: 2022
• 作者: Nishigaki Akari;Maruyama Mihoko;Tanaka Shun-ichi;Yoshikawa Hiroshi Y.;Imanishi Masayuki;Yoshimura Masashi;Mori Yusuke;Takano Kazufumi;内山 昌典，橋口 早紀，佐分利 亘，森 春英
• 通讯作者: 内山 昌典，橋口 早紀，佐分利 亘，森 春英