Molecular basis and functional modulation of carbohydrate epimerases and isomerases useful for carbohydrate conversion

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糖質の高度利用には，希少糖質の効率合成法が必要である.本研究ではセロビオース2-エピメラーゼ (CE酵素) や マンノースイソメラーゼなど様々な糖質異性化酵素を含む酵素群の反応特異性を制御する機構の解明と高活性変異酵素の開発を目的とした.エピメラーゼ活性のみを示すCE (1機能CE酵素) とエピメラーゼ活性とイソメラーゼ活性を示す2機能CE酵素の間で構造領域を入れ換えた一連のキメラ酵素のうち，(α/ α)6バレル触媒ドメインを構成するα-ヘリックス1と2，3と4，5と6を入れ替えたキメラ酵素の機能を解析した．Glcβ-4ManとGlcβ-4Fruに対する初速度に基づき2機能CE酵素に1機能CE酵素のα-ヘリックス1と2，3と4を入れ換えたキメラ酵素は野生型2機能酵素よりも低いイソメラーゼ特異性を示した.すなわち，α-ヘリックス１から4に至る領域がイソメラーゼ反応に重要な構造を含むことが示唆された．マンノースエピメラーゼ (ME酵素) については高活性変異酵素のハイスループットスクリーニング系の評価を行った．ME酵素をマンノース取り込み能を欠失させた大腸菌の細胞表層に発現させたところ，この細胞懸濁液中でのManの減少を確認した．すなわち，マンノースは菌体外ME酵素によるグルコースへの異性化を介して菌体に取り込まれたと理解された．またこの大腸菌形質転換体はマンノースを唯一の炭素源として生育した．組換えME酵素のC末端側にGFPタンパク質を融合し，菌体表層中のME酵素の簡便な定量方法を構築した．ランダム変異を導入したME変異酵素ライブラリーをグルコースとマンノースを唯一の炭素源とする培地で生育させるとマンノース培地でのコロニー数はグルコース培地でのコロニー数の5%程度であり，低活性変異酵素はマンノース培地で生育できずに除外されることが示唆された．