比較ゲノミクスから探る育種モデル食用菌の生殖成長相転換機構の全容解明

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昨年度までに、エノキタケの子実体形成株（正常株n）および子実体形成不全株（変異株d3, d4, d5）について、フラスコ内での子実体形成系を構築した。また、RNA-seq解析から、正常株の子実体形成期に特異的に発現する2つの遺伝子、Fv.FDS（Flammulina development specific gene）およびハイドロフォビンFv.hyd1を子実体形成関連遺伝子として特定した。2022年度はこれらの遺伝子の機能解析を目的として、FDS過剰発現株とノックアウト系統の作出を実施した。プロトプラスト-PEG法によって、変異株d3にFDS過剰発現カセットを導入した形質転換体Td3を作出した。Td3ではフラスコ内での子実体形成は観察できなかったものの、オガクズを含む菌床培地では正常株と同様に子実体を形成したことから、FDSは子実体形成に大きく関与する遺伝子であることを示した。一方、ノックアウト系統の作出においては遺伝子ターゲティング効率を減少させる非相同末端結合遺伝子の破壊に着手した。単核性発茸系統についてプロトプラスト-PEG法で非相同末端結合遺伝子Fv.LigIVの破壊用コンストラクトを導入した。形質転換後、ハイグロマイシンを含む選択培地に出現したコロニーを分離した。得られたFv.LigⅣ 破壊候補系統について、UV照射した菌糸体からRNAを抽出し、RT-PCRにてFv.LigⅣの発現確認を行った。その結果、一次スクリーニングで得られた904系統のうちの1系統においてFv.LigⅣ の破壊をゲノムレベルで確認するとともに、RT-PCRによりFv.LigⅣ 発現のノックアウトを確認した。