Construction of artificial chromosomes using silkworm chromosomes with holocentric kinetochores

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本申請では、カイコ染色体の特徴（分散型動原体、反復配列とレトロトランスポゾンによるテロメア）を利用し、効率よく細胞内で維持可能な人工染色体の構築を目的としている。細胞外から導入されたDNAが、細胞内に長期間維持されるには、効率の良いDNA複製と分配が必要である。そのためには、DNA複製起点、セントロメアと動原体タンパク質複合体、テロメアが必要なエレメントである。① DNA複製起点を含むDNA断片の単離、② 動原体タンパク質をBac DNA上に局在化させることによるDNA分配効率の向上を試みている。昨年度に引き続き本年度も、DNA上に動原体タンパク質複合体を局在化させる技術開発、および、カイコ細胞内で効率よく複製する複製起点を含むDNA断片の単離のための技術基盤の整備を行った。まず、カイコ細胞内でDNAを長期間維持させるのに必要なエレメントをもつ長鎖環状DNAを、効率よくin vitroで構築するために、Golden gate法を用いることにした。この方法では、~ 10 kbp程度のエレメントをそれぞれプラスミドを作製しておき、様々な組み合わせで酵素反応させることにより、簡便に効率よく様々な種類の長鎖環状DNAを作製可能になる。そのためのベクター系のシステムを作成し、~ 100 kbp程度の長鎖DNAが構築可能になった。また、動原体タンパク質を長期間、細胞内で発現させると発現量の低下がみられたため、ヒトFKBP12、および、大腸菌dihydrofolate reductase (ecDHFR)タグを使用して、可逆的に細胞内のタンパク質量を制御可能なシステムも構築した。動原体タンパク質をDNA上に局在化するために、dCas9を使用して目的タンパク質を染色体上に局在化することができた。