Construction of artificial chromosomes using silkworm chromosomes with holocentric kinetochores

利用具有全着丝粒着丝粒的家蚕染色体构建人工染色体

• 批准号: 21K05617
• 负责人: 門 宏明
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05617/
• 关键词: 分散型動原体; カイコ; 人工染色体; DNA複製起点; セントロメア

本申請では、カイコ染色体の特徴（分散型動原体、反復配列とレトロトランスポゾンによるテロメア）を利用し、効率よく細胞内で維持可能な人工染色体の構築を目的としている。細胞外から導入されたDNAが、細胞内に長期間維持されるには、効率の良いDNA複製と分配が必要である。そのためには、DNA複製起点、セントロメアと動原体タンパク質複合体、テロメアが必要なエレメントである。① DNA複製起点を含むDNA断片の単離、② 動原体タンパク質をBac DNA上に局在化させることによるDNA分配効率の向上を試みている。昨年度に引き続き本年度も、DNA上に動原体タンパク質複合体を局在化させる技術開発、および、カイコ細胞内で効率よく複製する複製起点を含むDNA断片の単離のための技術基盤の整備を行った。まず、カイコ細胞内でDNAを長期間維持させるのに必要なエレメントをもつ長鎖環状DNAを、効率よくin vitroで構築するために、Golden gate法を用いることにした。この方法では、~ 10 kbp程度のエレメントをそれぞれプラスミドを作製しておき、様々な組み合わせで酵素反応させることにより、簡便に効率よく様々な種類の長鎖環状DNAを作製可能になる。そのためのベクター系のシステムを作成し、~ 100 kbp程度の長鎖DNAが構築可能になった。また、動原体タンパク質を長期間、細胞内で発現させると発現量の低下がみられたため、ヒトFKBP12、および、大腸菌dihydrofolate reductase (ecDHFR)タグを使用して、可逆的に細胞内のタンパク質量を制御可能なシステムも構築した。動原体タンパク質をDNA上に局在化するために、dCas9を使用して目的タンパク質を染色体上に局在化することができた。

the present invention utilize that characteristics of chromosome (dispersed kinetosomes, repeated alignment, and multiple chromosome) and maintains the possibility of constructing artificial chromosome in cells DNA replication and distribution are essential for extracellular and intracellular maintenance. DNA replication origin, protoplast, plastid complex DNA replication start point contains DNA fragment separation, and kinetosome DNA fragment is located in the middle of DNA distribution. This year, the development of DNA gene expression complexes and the preparation of DNA gene expression vectors containing DNA fragments were carried out. The long term maintenance of DNA in cells requires the use of the Golden Gate method. The method is simple, efficient, and easy to produce long-locked circular DNA of all kinds. The long chain DNA of ~ 100 kbp can be constructed. In addition, in the long term, the intracellular production of protozoa is reduced, and in the long term, the intracellular production of protozoa is reduced. In the long term, the intracellular production of protozoa is reduced. In the long term, the intracellular production of protozoa is reduced. The DNA of the chromosome is not available.

项目成果

カイコ培養細胞の有糸分裂に関わる機能未知遺伝子の解析

培养蚕细胞有丝分裂相关功能未知基因的分析

• 发表时间: 2022
• 作者: Mahadevan N;Kohno N;Nagao R;Nyein KT;Matsui H;Yamamoto M;Ichinose Y;Toyoda K;KouzaiY;Hisano H;Okamoto M;Noutoshi Y;米澤 徳隆・門 宏明・佐藤 昌直・藤田 龍介・李 在萬・日下部 宜宏
• 通讯作者: 米澤 徳隆・門 宏明・佐藤 昌直・藤田 龍介・李 在萬・日下部 宜宏

Construction of gene co-expression networks in cultured silkworm cells and identification of previously uncharacterized lepidopteran-specific genes required for chromosome dynamics

• DOI: 10.1016/j.ibmb.2022.103875
• 发表时间: 2022-11-25
• 期刊: INSECT BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY
• 影响因子: 3.8
• 作者: Mon，Hiroaki;Sato，Masanao;Kusakabe，Takahiro
• 通讯作者: Kusakabe，Takahiro