ヒザラガイの磁鉄鉱歯特異的な歯舌マトリックスタンパク質の機能解明

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本研究では、ヒザラガイの歯冠部特異的タンパク質である歯舌マトリックスタンパク質１（RTMP1）について、遺伝子ノックダウンおよび組換えタンパク質を用いた機能解析を行ない、歯冠部への酸化鉄沈着におけるRTMP1の役割を明らかにすることを目的とする。2021年度は、まず、オオバンヒザラガイの遺伝子ノックダウンシステムの確立を目指して実験を行った。実験には、北海道大学の厚岸臨海実験所のご協力の下、採取したオオバンヒザラガイ個体を用いた。使用する個体重量、飼育条件、dsRNA注入量およびノックダウン後、表現型解析を行なうまでの時間を検討し、各条件について最適化した。その結果、RTMP1遺伝子をターゲットとするdsRNAを注入した個体において、陰性対照と比較して有意にRTMP1遺伝子発現量が低下することが確認された。顕微鏡観察から、遺伝子発現量が低下した個体において、歯の沈着鉄量の減少を示唆する結果が得られた。また、in vitro機能解析に向けて、酵母でRTMP1を組換え発現させ、その精製を行った。RTMP1遺伝子全長及びシグナル配列をコードする領域を除いたRTMP1遺伝子（RTMP1-delta-ss）をGST融合発現用ベクターpEG(KT)に組み込み酵母に発現させた。研究分担者の守屋とともに、プロモーター、可溶化タグ、コドンの最適化による発現量の増加を試みた結果、RTMP1-delta-ssの発現を確認することができた。また、発現が確認されたRTMP1-delta-ssについて、グルタチオンビーズを用いた粗精製に成功した。