無機硫黄化合物の酵素化学の確立とその応用

无机硫化合物酶化学的建立及其应用

• 批准号: 21K05876
• 负责人: 金尾 忠芳
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05876/
• 关键词: 無機硫黄化合物; 異化的硫黄代謝; 酵素化学; 結晶構造解析; 酵素反応機構; 遺伝子組換え発現; refoliding; 部位特異的変異導入; 硫黄代謝; refolding; 硫黄酸化細菌; 好酸性細菌

鉄硫黄酸化細菌の一種 Acidithiobacillus ferrooxidans を研究の対象とし、硫黄化合物を代謝する酵素であるテトラチオン酸ハイドロラーゼ(4THase)について詳細な研究を行った。この4THaseは、無機硫黄化合物の加水分解反応を触媒し一部の好酸性微生物にのみ確認されている極めてユニークな酵素である。当該研究では既に、本菌の4THase遺伝子(Af-tth)の同定、結晶化による立体構造を決定した。さらに本酵素の活性中心D325がテトラチオン酸の加水分解に関わる新規な反応メカニズムを解明した。R4年度はD325の近傍に位置する３つのメチオニン残基（M172, M238, M279）から成るMetクラスターが硫黄原子を捕捉している様子を観察結果から、これらをCysに置換し、補足した硫黄原子が反応生成物の何に由来するのかを確認する実験に着手した。現在はこの変異酵素の結晶化を行っている。一方で、Af-tth遺伝子がテトラチオン酸を生育基質とした場合に強く発現することから、この発現を担うプロモーターについても解析を行なった結果、Af-tthの転写開始点とプロモーター領域を同定し、これを利用した本菌の組換え遺伝子発現ベクターを構築した。接合伝達による大腸菌とのシャトルベクターで、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を本プロモーターの支配下においたベクタープラスミドをA. ferrooxidansに導入し、テトラチオン酸を生育基質とした組換え菌株は、薬剤耐性を持ち緑色蛍光を示した。これによりGFPのA. ferrooxidansを宿主とした組換え発現に成功した。さらにHis-tagコドンを導入したAf-tthを発現させるベクターを本菌に導入し、アフィニティカラムにより簡便に高純度で精製した組換えAf-Tth(x6H)は本来のAf-Tthと同等の活性を有していた。

Acidithiobacillus ferrooxidans, a kind of iron sulfur-acidifying bacteria, has been studied in detail for its enzyme for sulfur compound metabolism. The 4THase is a catalyst for the hydrolysis of inorganic sulfur yellow compounds. In this study, the identity and crystallization of the Af-tth gene of the strain were determined. The activity center D325 of this enzyme is related to the hydrolysis of acetic acid. In R4, three residues (M172, M238, M279) near D325 were detected and the origin of sulfur atom was confirmed. Now the crystallization of different enzymes is in progress. In one case, the Af-tth gene is used to express the growth substrate. In the other case, the gene is used to express the growth substrate. Conjugated DNA: E. coli, GFP, GFP Ferrooxidans are introduced into the medium, and the green light is displayed.これによりGFPのA. Ferrooxidans were successfully transformed into a host. The His-tag gene was introduced into the strain, and the Af-Tth (x6H) gene was found to have the same activity as the original Af-Tth gene.