無機硫黄化合物の酵素化学の確立とその応用

鉄硫黄酸化細菌の一種 Acidithiobacillus ferrooxidans を研究の対象とし、硫黄化合物を代謝する酵素であるテトラチオン酸ハイドロラーゼ(4THase)について詳細な研究を行った。この4THaseは、無機硫黄化合物の加水分解反応を触媒し一部の好酸性微生物にのみ確認されている極めてユニークな酵素である。当該研究では既に、本菌の4THase遺伝子(Af-tth)の同定、結晶化による立体構造を決定した。さらに本酵素の活性中心D325がテトラチオン酸の加水分解に関わる新規な反応メカニズムを解明した。R4年度はD325の近傍に位置する３つのメチオニン残基（M172, M238, M279）から成るMetクラスターが硫黄原子を捕捉している様子を観察結果から、これらをCysに置換し、補足した硫黄原子が反応生成物の何に由来するのかを確認する実験に着手した。現在はこの変異酵素の結晶化を行っている。一方で、Af-tth遺伝子がテトラチオン酸を生育基質とした場合に強く発現することから、この発現を担うプロモーターについても解析を行なった結果、Af-tthの転写開始点とプロモーター領域を同定し、これを利用した本菌の組換え遺伝子発現ベクターを構築した。接合伝達による大腸菌とのシャトルベクターで、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を本プロモーターの支配下においたベクタープラスミドをA. ferrooxidansに導入し、テトラチオン酸を生育基質とした組換え菌株は、薬剤耐性を持ち緑色蛍光を示した。これによりGFPのA. ferrooxidansを宿主とした組換え発現に成功した。さらにHis-tagコドンを導入したAf-tthを発現させるベクターを本菌に導入し、アフィニティカラムにより簡便に高純度で精製した組換えAf-Tth(x6H)は本来のAf-Tthと同等の活性を有していた。

鉄硫黄酸化細菌の一種 Acidithiobacillus ferrooxidans を研究の対象とし、硫黄化合物を代謝する酵素であるテトラチオン酸ハイドロラーゼ(4THase)について詳細な研究を行った。この4THaseは、無機硫黄化合物の加水分解反応を触媒し一部の好酸性微生物にのみ確認されている極めてユニークな酵素である。当該研究では既に、本菌の4THase遺伝子(Af-tth)の同定、結晶化による立体構造を決定した。さらに本酵素の活性中心D325がテトラチオン酸の加水分解に関わる新規な反応メカニズムを解明した。R4年度はD325の近傍に位置する３つのメチオニン残基（M172, M238, M279）から成るMetクラスターが硫黄原子を捕捉している様子を観察結果から、これらをCysに置換し、補足した硫黄原子が反応生成物の何に由来するのかを確認する実験に着手した。現在はこの変異酵素の結晶化を行っている。一方で、Af-tth遺伝子がテトラチオン酸を生育基質とした場合に強く発現することから、この発現を担うプロモーターについても解析を行なった結果、Af-tthの転写開始点とプロモーター領域を同定し、これを利用した本菌の組換え遺伝子発現ベクターを構築した。接合伝達による大腸菌とのシャトルベクターで、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を本プロモーターの支配下においたベクタープラスミドをA. ferrooxidansに導入し、テトラチオン酸を生育基質とした組換え菌株は、薬剤耐性を持ち緑色蛍光を示した。これによりGFPのA. ferrooxidansを宿主とした組換え発現に成功した。さらにHis-tagコドンを導入したAf-tthを発現させるベクターを本菌に導入し、アフィニティカラムにより簡便に高純度で精製した組換えAf-Tth(x6H)は本来のAf-Tthと同等の活性を有していた。