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カリウムチャネルKcsAの脂質内高分解能構造解析によるゲーティング機構の解明

通过脂肪乳高分辨率结构分析阐明钾通道 KcsA 的门控机制

基本信息

批准号：
21K06030
负责人：
高崎寛子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、イオンチャネルのモデルタンパク質であるKcsAの構造解析を行い、多様に存在するイオンチャネル間の共通のゲーティング機構を明らかにすることを目的としている。ナノディスク技術を用いて、生体内と同じ脂質二重膜内に存在するKcsAを精製し、中性溶液中の閉構造、酸性溶液中の開構造をクライオ電子顕微鏡単粒子解析法を用いて明らかにする。本年度は、精製脂質を用いてKcsAを含むナノディスクを形成させ、形成条件の最適化に成功した。使用した脂質は、KcsAの活性が確認されている、POPEとPOPGの3:1混合脂質である。この脂質混合液、membrane scaffold protein（MSP）のうちMSP1D1（ナノディスク直径9.6 nm）とKcsAをさまざまな量比で混ぜたのち、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて、分子サイズごとに分取した。分取した溶液を用いてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、MSP1D1とKcsAがともに存在することを確認した。さらに、負染色法により電子顕微鏡で形状を確認した。その結果、均質な大きさのナノディスクが観察され、さらにKcsAがナノディスク内に埋め込まれたような像を得ることができた。今後は、ナノディスクに組み込まれたKcsAを大量精製し、クライオ電子顕微鏡観察を行う。大量データ収集可能な観察サンプルのスクリーニングを行った後、実際のデータ収集と単粒子解析を行う。すでにKcsAの可溶化に実績のあるアンフィポールを用い、クライオ電子顕微鏡・単粒子解析法により大量データ収集と高分解能構造解析を行い、それをナノディスクでの解析に応用する。

This study is aimed at clarifying the structural analysis of KcsA and the common mechanism of KcsA. The application of electron microscopy in particle analysis, purification of KcsA in lipid double membranes, closed structures in neutral solutions and open structures in acidic solutions This year, we successfully optimized the conditions for the formation of refined lipids using KcsA. The activity of KcsA was confirmed by using lipid and POPE, POPG and 3:1 lipid mixture. The lipid mixture, membrane scaffold protein (MSP), MSP1D1 (diameter 9.6 nm) and KcsA were used in combination with the mixture and molecular separation. The separation of the solution was carried out using SDS, and the presence of MSP1D1 and KcsA was confirmed. The shape was confirmed by electron microscopy using negative staining. The result is that the quality of the product is very high, and the quality of the product is very high. In the future, we will continue to improve the quality of KcsA by electronic microscope. A large number of data sets may be detected after the detection of the data set and the analysis of the data set. The solubility of KcsA is determined by electron microscope and single particle analysis.