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糖転移酵素の基質認識のゆらぎを利用した高付加価値抗体生産細胞の構築

利用糖基转移酶底物识别波动构建高附加值抗体产生细胞

基本信息

批准号：
21K06081
负责人：
三崎亮
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06081/
关键词：
CHO細胞糖鎖脱フコシル化アラビノースフコース抗体

项目摘要

フコース結合型（フコシル化）糖鎖の合成経路を担うGDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ（GMD）をノックアウトしたチャイニーズハムスターの細胞（ΔGMD）を用いて、細胞内タンパク質糖鎖に付加するフコースをフコース構造類似糖へ置換することを試みた。本年度は、野生株とΔGMD株を接着細胞として培養し血清存在下で置換効率が受ける影響を調査した。野生株とΔGMD株におけるフコシル化糖鎖含量は、全糖鎖（全可溶性タンパク質由来の糖鎖のため約70%の高マンノース型糖鎖を含む）のうちそれぞれ14.5%と1.4%であった。各細胞について、終濃度が10 mM（当該濃度では浸透圧による細胞成長の影響は特に見られない）となるようにフコースの構造類似糖であるアラビノースを添加した培地で3週間継代培養し、細胞より糖鎖を調製後に高速液体クロマトグラフィーと質量分析器でその構造を解析した。その結果、前年度はごく微量ながら検出に成功したが、今回は野生株の糖鎖からは質量分析器レベルでアラビノースの付加した構造は検出できなかった。これに対し、ΔGMD株の糖鎖ではフコシル化糖鎖量が1.2%に減少し、さらにアラビノース付加型構造を2.4%の含量で検出することができた。また、アラビノースの代わりに同じくフコースの構造類似糖であるL-ガラクトースを10 mMの濃度で培地に添加することで、ガラクトース付加型糖鎖を生産することにも成功した。野生株でアラビノースへの置換が確認できなかったが、これは血清中に含まれるフコース転移酵素の基質GDP-フコースが置換効率に影響を与えていると推定された。

The synthesis pathway of the sugar chain in the cell (ΔGMD) is responsible for the GDP-linked 4,6-linked GMD pathway. The synthesis pathway in the cell (ΔGMD) is responsible for the GDP-linked 4,6-linked GMD pathway. This year, we investigated the effect of cell culture on the replacement efficiency of wild and ΔGMD strains in the presence of serum. The content of total glycocks in wild strains was 14.5% and 1.4% respectively. The final concentration of each cell is 10 mM (when the concentration is opposite to the osmotic pressure, the effect on cell growth is particularly observed). The structure of the cell is similar to that of the sugar. The structure of the cell is analyzed by mass analyzer after 3 weeks of culture. The results of the previous year's micro-detection were successful, and the quality analyzer of the wild plant was successful. In contrast, the amount of carbohydrate in ΔGMD strain decreased by 1.2%, and the amount of carbohydrate in Δ GMD strain increased by 2.4%. The structure of the sugar chain is similar to that of the sugar chain. The sugar chain is successfully produced by adding the sugar chain at a concentration of 10 mM. Wild strains are identified by the presence of matrix GDP-binding enzymes in the serum.