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The interrelationship between oligomer formation, DNA unwinding, and ATPase of a helicase studied using mutants lacking its C-terminal amino acids

使用缺乏 C 末端氨基酸的突变体研究低聚物形成、DNA 解旋和解旋酶 ATP 酶之间的相互关系

基本信息

批准号：
21K06103
负责人：
横田浩章
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The Graduate School for the Creation of New Photonics Industries
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06103/
关键词：
１分子計測ナノバイオ核酸酵素反応 1分子計測ヘリカーゼ

项目摘要

多くのタンパク質で見られる多量体形成は、タンパク質の活性制御などに重要な役割を果たす。研究代表者は非六量体型スーパーファミリー1ヘリカーゼUvrD のC末端アミノ酸欠失変異体が、野生型に比べて多量体を形成しづらいことを明らかにした。一方、その多量体構造は報告されておらず、多量体を構成する個々のUvrDがどのような相互作用を経て、ATP加水分解エネルギーを使いDNA巻き戻しをしているのかは不明である。そこで本研究ではUvrDのDNA巻き戻し機能に関わる多量体形成に重要なC末端アミノ酸に注目し、UvrDの多量体構造・DNA巻き戻し機能・ATPの結合解離（ATPase）の相関関係を蛍光1分子イメージングで明らかにする。そしてこれまで明らかにするのが困難だったタンパク質の多量体形成とそれによる機能発現の間のブラックボックスに迫ることを目指している。研究代表者は、多量体を形成できないとされるC末端40アミノ酸欠損変異体（UvrDΔ40C）が定説に反し、二量体あるいは三量体でDNAを巻き戻していることを明らかにしている（Biophysical Journal (2020)、生物物理 (2021)、Biophysics and Physicobiology (2022)）。2022年度は、UvrD のC末端アミノ酸の多量体形成への役割をさらに理解するために、ヘリカーゼスーパーファミリーで保存されているサブドメイン外にあるC末端アミノ酸すべてを欠失させた変異体のDNA巻き戻し過程の解析を進め、UvrD－DNA間の結合・解離速度定数を得た。また、UvrDのサブドメインの特定サイトの特異的蛍光標識、UvrD多量体構造の蛍光1分子イメージング、ゼロモード導波路による高濃度蛍光性ATP条件下の蛍光1分子イメージング、DNA巻き戻しの1塩基分解能観察に取り組んだ。

多くのタンパク質で見られる多量体形成は、タンパク質の活性制御などに重要な役割を果たす。研究代表者为非六量体型嗜铬细胞瘤1型嗜铬细胞瘤UvrD胞C端嗜铬细胞瘤失活体，原生型嗜铬细胞瘤多量体形成嗜铬细胞瘤最终明了嗜铬细胞瘤。一方，大量体细胞制造的肿瘤细胞骨架，多量体细胞形成的肿瘤墙板中UvrD与肿瘤细胞相互作用的介绍骨架，ATP加水分解酶诱导的DNA突变，肿瘤细胞骨架中未发现肿瘤细胞。本研究利用UvrD介导的DNA还原能力，将UvrD多量体形成的重要的C端磷酸酶注目，UvrD多量体形成·DNA还原能力·ATP酶合解酶（ATP酶）相结合，最终发光1分子，形成一个完整的荧光团。そしてこれまで明らかにするのが困難だったタンパク質の多量体形成とそれによる機能発現の間のブラックボックスに迫ることを目指している。研究代表者陈伟、多量体形成的核糖体蛋白酶抑制剂C端40核糖酸酶抑制体（UvrDΔ40C）确定的酶抑制剂、二量体核糖体蛋白酶抑制剂三量体核糖体DNA末端修饰酶抑制剂（Biophysical Journal（2020）、生物物理（2021）、Biophysics and Physicobiology（2022））。2022年度报告、UvrD C末端脱氧核糖核酸多量体形成突变体切割酶解理解报告、UvrD-DNA DNA测序融合·解链度定量分析报告、UvrD-DNA测序融合·解链度定量分析报告。紫外线、UvrD紫外线荧光检测仪检测特定波长的紫外线荧光，UvrD多量体发光1分子荧光检测仪，紫外线荧光检测仪的高灵敏度荧光性ATP条件下的荧光1分子荧光检测仪，DNA荧光检测仪的1个碱基分解能示波提取申请表。