CRISPRスクリーニングで同定したサフォードウイルス受容体候補遺伝子の機能解析

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本研究は、Saffold virus (SAFV) の感染受容体を同定し、最終的に SAFV の病原性発現の分子機構を明らかにすることを目的とする。SAFV 感受性細胞である HeLa 細胞を用いた CRISPR library スクリーニングから、細胞表面のへパラン硫酸 (HS) が SAFV の感染に重要であることを見出した。しかし、細胞表面に HS が存在しない細胞において、SAFV 感染の明らかな遅延が見られるものの、感染・増殖を完全には阻害することはできなかった。このことから、HS は attachement receptor のひとつであり、他にも受容体となる分子が存在すると考えられた。そこで、本研究では HS 以外の SAFV 受容体を同定するために、細胞表面に HS が存在しない (HS(-)) HeLa 細胞株を作出し、この細胞株を用いた CRISPR library スクリーニングを行った。令和4年度は、まず、CRISPR KO library を導入した細胞に SAFV を感染後、生き残った SAFV 耐性化細胞に導入された sgRNA 配列を次世代シーケンシングにより決定した。その結果得られた候補遺伝子群から、細胞膜上での発現に着目し、それらの遺伝子について、HeLa および HS(-) HeLa 細胞における KO 細胞と、SAFV 非感受性細胞である BHK-21 細胞における過剰発現細胞を作出し、ウイルスの感染と増殖を評価した。さらに、受容体候補分子と SAFV の結合を pulldown assay および attachement assay によって評価した。これらの結果から、HS 以外の SAFV 受容体を同定することができた。