CRISPRスクリーニングで同定したサフォードウイルス受容体候補遺伝子の機能解析

CRISPR筛选鉴定的萨福德病毒受体候选基因的功能分析

• 批准号: 21K07045
• 负责人: 大桑 孝子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kanazawa Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07045/
• 关键词: Saffold virus; 感染受容体; CRISPR/Cas9; sgRNAライブラリー; サフォードウイルス

本研究は、Saffold virus (SAFV) の感染受容体を同定し、最終的に SAFV の病原性発現の分子機構を明らかにすることを目的とする。SAFV 感受性細胞である HeLa 細胞を用いた CRISPR library スクリーニングから、細胞表面のへパラン硫酸 (HS) が SAFV の感染に重要であることを見出した。しかし、細胞表面に HS が存在しない細胞において、SAFV 感染の明らかな遅延が見られるものの、感染・増殖を完全には阻害することはできなかった。このことから、HS は attachement receptor のひとつであり、他にも受容体となる分子が存在すると考えられた。そこで、本研究では HS 以外の SAFV 受容体を同定するために、細胞表面に HS が存在しない (HS(-)) HeLa 細胞株を作出し、この細胞株を用いた CRISPR library スクリーニングを行った。令和4年度は、まず、CRISPR KO library を導入した細胞に SAFV を感染後、生き残った SAFV 耐性化細胞に導入された sgRNA 配列を次世代シーケンシングにより決定した。その結果得られた候補遺伝子群から、細胞膜上での発現に着目し、それらの遺伝子について、HeLa および HS(-) HeLa 細胞における KO 細胞と、SAFV 非感受性細胞である BHK-21 細胞における過剰発現細胞を作出し、ウイルスの感染と増殖を評価した。さらに、受容体候補分子と SAFV の結合を pulldown assay および attachement assay によって評価した。これらの結果から、HS 以外の SAFV 受容体を同定することができた。

This study aims to identify the infection receptors of Saffold Virus (SAFV) and ultimately to clarify the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of SAFV. SAFV-responsive cells are important for SAFV infection in HeLa cells using CRISPR library. The cell surface HS is present in the cell, and the SAFV infection is delayed. The infection and proliferation are completely blocked. This is the first time that a molecule has been attached to a receptor. In this study, the presence of HS on the surface of HeLa cell lines was determined by using CRISPR library. In 2004, CRISPR KO library was introduced into SAFV infected cells and SAFV resistant cells. The results were as follows: candidate gene subgroup, expression on cell membrane, expression on cell membrane, expression on cell membrane, The combination of the receptor candidate molecule and SAFV in the pulldown assay and the attachment assay is evaluated. SAFV receptors other than HS are identical.