Establishment and operation of a method for evaluating enzyme activity in VLCAD and MCAD

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本年度は前年度に引き続き，LC-MS/MSを用いた酵素活性測定系の確立，および遺伝子導入の母体となる(VLCAD-/MCAD-)HEK293細胞の作成を行った．LC-MS/MS分析についてはHEK293細胞を用い，VCLAD活性測定の系を確定した．具体的にはC16-CoAを基質として加えたのちのC16:1-CoAを測定した．分析にはLCMS-8030plusを用い，移動相はアセトニトリル＋炭酸アンモニウム10ｍMを用い，カラムはメタルフリーカラムL-colummn2 C8 (3μM,12nm,CERI) を用いて分析を行った．時系列で生成されるC16:1-CoAを定量し，本アッセイにおける反応時間は2.5分が最適であることを確認し，7.5分で基質生成はプラトーに達した．また，HEK293細胞については今年度はCRISPR-Cas9システムを用いてVLCADをノックアウトした細胞を作成し，VLCAD蛋白が発現していない事を確認した．ここにトランスフェクションする変異VLCADを含むベクターを作成した．作成ベクターは，重症型バリアントであるc.533G>A(G185S)，筋型バリアントといわれるc.790A>G(K294E)，c.1144A>C(K382Q)，NBS開始後に発見されている軽症と推定されるc.1820G>C(C607S)，c.1438G>A(M478I)，c.1226C>T(T409M)，c.865G>A(G289R)を作成した．