Establishment and operation of a method for evaluating enzyme activity in VLCAD and MCAD

VLCAD和MCAD酶活性评价方法的建立和运行

• 批准号: 21K07753
• 负责人: 小林 弘典
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: Shimane University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07753/
• 关键词: VLCAD; 極長鎖アシルCoA脱水素酵素; 新生児マススクリーニング; 残存酵素活性測定; LC-MS/MS; 極長鎖アシルCoA脱水素酵素欠損症; 中鎖アシルCoA脱水素酵素欠損症; 酵素活性測定; タンデムマス; 脂肪酸代謝異常症; 酵素活性; MCAD

本年度は前年度に引き続き，LC-MS/MSを用いた酵素活性測定系の確立，および遺伝子導入の母体となる(VLCAD-/MCAD-)HEK293細胞の作成を行った．LC-MS/MS分析についてはHEK293細胞を用い，VCLAD活性測定の系を確定した．具体的にはC16-CoAを基質として加えたのちのC16:1-CoAを測定した．分析にはLCMS-8030plusを用い，移動相はアセトニトリル＋炭酸アンモニウム10ｍMを用い，カラムはメタルフリーカラムL-colummn2 C8 (3μM,12nm,CERI) を用いて分析を行った．時系列で生成されるC16:1-CoAを定量し，本アッセイにおける反応時間は2.5分が最適であることを確認し，7.5分で基質生成はプラトーに達した．また，HEK293細胞については今年度はCRISPR-Cas9システムを用いてVLCADをノックアウトした細胞を作成し，VLCAD蛋白が発現していない事を確認した．ここにトランスフェクションする変異VLCADを含むベクターを作成した．作成ベクターは，重症型バリアントであるc.533G>A(G185S)，筋型バリアントといわれるc.790A>G(K294E)，c.1144A>C(K382Q)，NBS開始後に発見されている軽症と推定されるc.1820G>C(C607S)，c.1438G>A(M478I)，c.1226C>T(T409M)，c.865G>A(G289R)を作成した．

This year, compared with the previous year, the enzyme activity assay system for LC-MS/MS was established, and the parent (VLCAD-/MCAD-)HEK 293 cells were introduced into the system. The enzyme activity assay system for VCLAD was established. Specific C16-CoA matrix is added to C16:1-CoA. The analysis was carried out using LCMS-8030plus, mobile phase, and L-column mn 2 C8 (3μM,12nm,CERI). The time series was generated by C16:1-CoA, and the reaction time was 2.5 minutes. The optimal reaction time was confirmed by 7.5 minutes. HEK293 cells were used to produce CRISPR-Cas9 protein, and VLCAD protein was found in cells. The VLCAD system is composed of a variety of components. c.533G>A(G185S) for severe type, c.790A>G(K294E), c.1144A>C(K382Q) for muscle type, c.1820G>C(C607S), c.1438G>A(M478I), c.1226C>T(T409M), c.865G>A(G289R) for NBS onset.

项目成果

The frequencies of very long-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency genetic variants in Japan have changed since the implementation of expanded newborn screening

• DOI: 10.1016/j.ymgme.2022.03.009
• 发表时间: 2022-05-09
• 期刊: MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM
• 影响因子: 3.8
• 作者: Osawa, Yoshimitsu;Kobayashi, Hironori;Taketani, Takeshi
• 通讯作者: Taketani, Takeshi