Mechanisms of CHI3L1-mediated p53 suppression in the early stage of colon cancer

炎症性腸疾患における慢性炎症時に、腸管上皮細胞が異形成から早期癌を起こす過程で、酵素活性を持たないがキチン質に結合能を有するキチナーゼ３様タンパク１型 (CHI3L1)が深く関与していることが知られている。CHI3L1には、144～174番目のアミノ酸に核内局在にかかわると推測されるシークエンスが存在し、最尾部(170～174番目)に推測上の細胞周期にかかわる蛋白であるサイクリンの結合部位が存在し、その近傍に２ヶ所のサイクリンリン依存性キナーゼ（CDK)のリン酸化部位が存在していることも確認している。我々は、CRISPR/Cas9法を使って、ヒト大腸癌細胞株であるSW480細胞のCHI3L1蛋白内の170～174番目のアミノ酸を欠失した安定発現細胞株を作成して、この細胞をknockout (KO)株と命名した。さらに、このKO細胞に全長のヒトCHI3L1 cDNAを組み込んだpEGFP N1ベクターを導入した安定発現株（W2D11株）と同一ベクターのみを導入したmock安定発現株（M3C6株）を作成した。我々は、上記３細胞株と野生株（WT株）の４種類を合計30匹のbalb/cAJcl-nuヌードマウスの後背部に接種したが、SW480細胞が生着したのは約15％のW2D11株のみであり、腹水由来のSW480細胞がこのような腫瘍の生着実験には向かないことが分かった。前年度の実験で、CHI3L1の核内移行にかかわると考えられる２種類の分子である、蛋白X, 蛋白Yを同定したが、pCDNA3.1(+)ベクター（FLAG-tag）に全長のヒト蛋白Xまたは蛋白Y ｃDNAを挿入して強制発現させたところ免疫染色およびIP western blot法の両方でCHI3L1/蛋白X, CHI3L1/蛋白Y の結合を確認できた。現在、Cell Signaling (Danvers, MA)のマウス抗ヒトp53モノクローナル抗体を免疫染色に使用しているが、SW480細胞およびヒト大腸癌組織の両方でp53発現が弱くしか認められず、今後は他社の抗p53抗体に変更して実験を進める予定である。

炎症性腸疾患における慢性炎症時に、腸管上皮細胞が異形成から早期癌を起こす過程で、酵素活性を持たないがキチン質に結合能を有するキチナーゼ３様タンパク１型 (CHI3L1)が深く関与していることが知られている。CHI3L1には、144～174番目のアミノ酸に核内局在にかかわると推測されるシークエンスが存在し、最尾部(170～174番目)に推測上の細胞周期にかかわる蛋白であるサイクリンの結合部位が存在し、その近傍に２ヶ所のサイクリンリン依存性キナーゼ（CDK)のリン酸化部位が存在していることも確認している。我々は、CRISPR/Cas9法を使って、ヒト大腸癌細胞株であるSW480細胞のCHI3L1蛋白内の170～174番目のアミノ酸を欠失した安定発現細胞株を作成して、この細胞をknockout (KO)株と命名した。さらに、このKO細胞に全長のヒトCHI3L1 cDNAを組み込んだpEGFP N1ベクターを導入した安定発現株（W2D11株）と同一ベクターのみを導入したmock安定発現株（M3C6株）を作成した。我々は、上記３細胞株と野生株（WT株）の４種類を合計30匹のbalb/cAJcl-nuヌードマウスの後背部に接種したが、SW480細胞が生着したのは約15％のW2D11株のみであり、腹水由来のSW480細胞がこのような腫瘍の生着実験には向かないことが分かった。前年度の実験で、CHI3L1の核内移行にかかわると考えられる２種類の分子である、蛋白X, 蛋白Yを同定したが、pCDNA3.1(+)ベクター（FLAG-tag）に全長のヒト蛋白Xまたは蛋白Y ｃDNAを挿入して強制発現させたところ免疫染色およびIP western blot法の両方でCHI3L1/蛋白X, CHI3L1/蛋白Y の結合を確認できた。現在、Cell Signaling (Danvers, MA)のマウス抗ヒトp53モノクローナル抗体を免疫染色に使用しているが、SW480細胞およびヒト大腸癌組織の両方でp53発現が弱くしか認められず、今後は他社の抗p53抗体に変更して実験を進める予定である。