疾患iPS細胞を用いた骨格筋代謝におけるミトコンドリア機能の意義の解明

使用患病 iPS 细胞阐明线粒体功能在骨骼肌代谢中的重要性

基本信息

批准号：
21K08587
负责人：
曽根正勝
金额：
$ 2.58万
依托单位：
St. Marianna University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08587/
关键词：
ミトコンドリア骨格筋ヒトiPS細胞代謝

项目摘要

昨年度までに、2名のミトコンドリア病の患者から樹立したiPS細胞のうち、mtDNAのA3243G変異が検出できない細胞クローンと, 高率で変異を有する細胞クローンの両方から骨格筋の誘導を、それぞれ2クローンづつ行うことができた。本年度は、これらミトコンドリア病疾患iPS細胞から誘導した骨格筋細胞において、mtDNA変異の有無によるミトコンドリア機能の差異の解析を行った。細胞外OCR（酸素消費速度）の測定は、XF24 Extracellular Flux Analyzer（Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA）を用いて，製造元のプロトコルにしたがって測定した．MatrigelでコーティングしたFluxPak-XFe24 アッセイパック（Agilent Technologies, CA,USA）付属の専用プレートにhiPS-MyoD細胞0.3×10^5個になるように播種し、10日間骨格筋誘導を行った。測定前日に、センサーカートリッジをキャリブラントで水和させた。XFミトストレスキット（Agilent Technologies, CA,USA）を用いて2uM Oligomycin,（ATP合成酵素阻害剤） 1.0uM FCCP（脱共役剤）, 0.5uM ROT/AA(ミトコンドリア電子伝達系阻害剤)を連続的に添加しOCRを測定した。結果は各ウェルの総細胞数をカウントし標準化した。細胞外フラックスアナライザーを用いた解析にて、mtDNAのA3243G変異（＋）と（－）の骨格筋細胞ではOCR（酸素消費速度）に差異を認め、中でもBasal OCR, ATP productionなどに差異を認めている。現在、上記の解析のｎの数を増やし、統計的な解析を行っている。

到去年，在两名线粒体疾病患者中建立的两个IPS细胞中诱导骨骼肌，每个克隆均未检测到MTDNA中的A3243G突变，并从突变率高的细胞克隆中检测到A3243G突变。今年，我们分析了源自线粒体疾病疾病的IPS细胞的骨骼肌细胞中线粒体功能的差异，具体取决于MTDNA突变是否存在。根据制造商的协议，使用XF24细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience，Billerica，MA，美国）测量细胞外OCR（氧消耗率）。将细胞接种到附着在涂在基质胶涂层的Fluxpak-XFE24测定包上的特殊板上（Agilent Technologies，CA，USA），至0.3×10^5 HIPS-MYOD细胞，并进行骨骼肌诱导10天。测量前一天，传感器墨盒用校准剂进行水合。通过连续添加2UM寡霉素（ATP合酶抑制剂），1.0UM FCCP（UNCOUPLER）和0.5UM ROT/AA（线粒体电子转移系统抑制剂），使用XF Mitosstress Kit（Agilent Technologies，CA，CA，CA，USA）来测量OCR。通过计算每个孔中的总细胞计数来归一化结果。使用细胞外通量分析仪的分析表明，A3243G突变（+）和（ - ）骨骼肌细胞以及基础OCR和ATP产生的差异，OCR（氧消耗率）的差异（氧气消耗率）差异。当前，上述分析中的N数量增加，并进行了统计分析。