疾患iPS細胞を用いた骨格筋代謝におけるミトコンドリア機能の意義の解明

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昨年度までに、2名のミトコンドリア病の患者から樹立したiPS細胞のうち、mtDNAのA3243G変異が検出できない細胞クローンと, 高率で変異を有する細胞クローンの両方から骨格筋の誘導を、それぞれ2クローンづつ行うことができた。本年度は、これらミトコンドリア病疾患iPS細胞から誘導した骨格筋細胞において、mtDNA変異の有無によるミトコンドリア機能の差異の解析を行った。細胞外OCR（酸素消費速度）の測定は、XF24 Extracellular Flux Analyzer（Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA）を用いて，製造元のプロトコルにしたがって測定した．MatrigelでコーティングしたFluxPak-XFe24 アッセイパック（Agilent Technologies, CA,USA）付属の専用プレートにhiPS-MyoD細胞0.3×10^5個になるように播種し、10日間骨格筋誘導を行った。測定前日に、センサーカートリッジをキャリブラントで水和させた。XFミトストレスキット（Agilent Technologies, CA,USA）を用いて2uM Oligomycin,（ATP合成酵素阻害剤） 1.0uM FCCP（脱共役剤）, 0.5uM ROT/AA(ミトコンドリア電子伝達系阻害剤)を連続的に添加しOCRを測定した。結果は各ウェルの総細胞数をカウントし標準化した。細胞外フラックスアナライザーを用いた解析にて、mtDNAのA3243G変異（＋）と（－）の骨格筋細胞ではOCR（酸素消費速度）に差異を認め、中でもBasal OCR, ATP productionなどに差異を認めている。現在、上記の解析のｎの数を増やし、統計的な解析を行っている。