CA19-9を標的とした共有結合DNAアプタマーによる膵癌新規治療法の開発

使用靶向 CA19-9 的共价 DNA 适体开发胰腺癌新疗法

• 批准号: 21K08724
• 负责人: 中村 透
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08724/
• 关键词: 膵癌; CA19-9; DNAアプタマー

当初、細胞表面糖鎖抗原CA19-9を標的とし膵癌細胞にsiRNA を選択的に導入する共有結合DNAアプタマーを開発し、K-rasG12D 遺伝子およびfibulin-3 遺伝子発現を抑制し、膵癌増殖抑制効果を検討する予定であった。実際に、細胞表面糖鎖抗原CA19-9とDNAアプタマーの結合を確認する際に、糖鎖抗原CA19-9基質の入手が困難であった。また、CA19-9は血中に分泌されるため、膵癌細胞へのAptamerの結合の効率が低下する可能性が考えられた。そこで、血中に分泌されることのない膵癌細胞の表面マーカーの一つであるMUC1 isoformYに対するAptamerを利用することとした。①MUC1 isoformY選択的に細胞内に核酸を取り込むことが可能な共有結合DNAアプタマーの作成、②MUC1 isoformYを標的としたDNAアプタマーとsiRNAを結合したDNA aptamer-siRNAによるK-rasG12Dおよびfibulin-3 遺伝子発現抑制実験、①②を組み合わせた共有結合DNA-Aptamer-siRNAを用い、ヒト膵癌同所移植モデルマウスによる前臨床試験を施行する。現在、膵癌細胞株のMUC1 isoformYの発現状況をWestern blot、RT-PCR、免疫染色で確認した。MUC1 isoformY陽性の細胞株に対するDNA aptamer-siRNAの取り込み実験を行い、蛍光顕微鏡でDNA aptamer-siRNAが取り込まれていることを確認した。また、krasに対するsiRNAの効果を確かめるためにsiRNAをトランスフェクションし、western blotとqPCRでk-rasタンパク質、mRNAをノックダウンしていることを確認した。しかし、共有結合のないDNA aptamer-siRNAによる細胞増殖抑制実験を行ったが有意な細胞増殖抑制を認めることができなかった。

In this paper, the expression of CA19 - 9, a cell surface glycoprotein, and siRNA targeting cancer cells were investigated. The results showed that the expression of K-ras G12D gene and fibulin-3 gene was inhibited by siRNA targeting cancer cells. In fact, it is difficult to identify the binding between CA19 - 9 and DNA. CA19 - 9 is secreted in the blood, and the efficiency of aptamer binding in cancer cells is low. The expression of MUC1 isoform on the surface of cancer cells is expressed in the blood. (1) DNA aptamer siRNA binding to MUC1 isoform Y target DNA aptamer siRNA binding to K-ras G12D and fibulin-3 gene expression inhibition;(2) DNA aptamer siRNA binding to MUC1 isoform Y target DNA aptamer siRNA binding to K-ras G12D and fibulin-3 gene expression inhibition;(3) DNA aptamer siRNA binding to MUC1 isoform Y target DNA aptamer siRNA binding to K-ras G12D and fibulin-3 gene expression inhibition;(4) DNA aptamer siRNA binding to MUC1 isoform Y target DNA aptamer siRNA binding to K-ras G12D and fibulin-3 gene expression inhibition;(5) DNA aptamer siRNA binding to MUC1 isoform Y target DNA aptamer siRNA binding to K-ras G12D and fibulin-3 gene expression inhibition;(6) DNA aptamer siRNA binding to MUC1 isoform DNA aptamer siRNA binding to K-ras G12D and fibulin-3 gene expression inhibition;(7) pre-clinical Western blot, RT-PCR and immunostaining were used to confirm the expression of MUC1 isoform Y in human cancer cell lines. DNA aptamer-siRNA detection in MUC1 isoformY-positive cell lines was confirmed by microscopy. The siRNAs were identified by Western blot and qPCR. DNA aptamer-siRNA is a consensus binding protein that inhibits cell proliferation.