遺伝子改変マウスを用いたLrig1による癌幹細胞維持機構の解明

使用转基因小鼠阐明 Lrig1 的癌症干细胞维持机制

• 批准号: 21K08797
• 负责人: 牧野 俊一郎
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08797/
• 关键词: Lrig1; 放射線; 癌幹細胞

腸管上皮の基底部から+4ポジションに位置するLrig1陽性の細胞は正常腸管の幹細胞性維持に重要であり、EGFRを負に制御して癌抑制的に働くと報告されている。一方、癌幹細胞におけるLrig1の機能は不明な点が多い。今回、Lrig1-GFPマウスを用いて化学発癌させたマウス大腸癌におけるLrig1発現の意義を明らかにすることを目的とした。2021年度は、免疫染色を施行し、ヒト大腸組織の正常部では陰窩が一部染まり、大腸癌組織で上皮細胞にLrig1の蛋白発現が確認された。大腸癌患者186例の原発巣より抽出したmRNAを用いてqRT-PCRによりLrig1発現量を測定した。その結果、Lrig1高発現群の無再発生存率が不良であることが分かった。 Lrig1-GFPマウスを用いた検討ではLrig1 発現の陽性コントロールとなる小脳皮質でGFPが強発現していた。このマウスにAOM (アゾキシメタン) の腹腔内投与とDSS (デキストラン硫酸ナトリウム) の自由飲水により大腸癌を作成し、腫瘍を蛍光顕微鏡で観察したところ大腸癌細胞の一部にGFP陽性細胞を確認した。2022年度には、10種類の癌細胞株での遺伝子発現をウエスタンブロットとフローサイトメーターで測定し、高発現株３株を特定した。siRNAによってノックダウン実験を行っているが、結果はsiRNAの種類によって齟齬があるため、再検して確認を要する。Lrig1-GFPマウスの大腸早期癌をLrig1抗体で免疫染色を行ったところ、 Lrig1は腫瘍の基底部の癌細胞に発現し、EGFRはその少し表層側に染色されており両者は排他的な発現パターンを示した。GFPマウス腫瘍をGentleMax (Miltenyi Biotec) でばらしてシングルセルRNAseqを行った結果、Lrig1遺伝子発現と細胞単位で相関を示す遺伝子が５つ抽出された。

Lrig1-positive cells located at the basal level of the intestinal epithelium are important for the maintenance of normal intestinal stem cells, and EGFR-negative cells are reported to inhibit cancer. One prescription, cancer stem cells, Lrig1 function is unknown. The significance of Lrig1 discovery in colorectal cancer In 2021, immunostaining was performed to confirm the expression of Lrig1 protein in epithelial cells of normal colorectal tissue and vaginal fossa. mRNA was extracted from 186 patients with colorectal cancer and detected by qRT-PCR. Results, Lrig1 high occurrence group and no recurrence survival rate are poor. Lrig1-GFP is strongly expressed in the cortex of small cells. AOM and DSS were administered intraperitoneally to establish colorectal cancer, and some GFP-positive cells were detected by microscopy. In 2022, 10 types of cancer cell lines were identified for gene development, and 3 highly developed strains were identified. The results of the siRNA test were as follows: siRNA type, siRNA resistance, siRNA re-test and siRNA identification. Immunostaining for Lrig1-GFP and Lrig1 antibodies in early colorectal cancer showed that Lrig1 was found in the basal part of the tumor, EGFR was found in the superficial part of the tumor, and EGFR was found in the exclusive part of the tumor. GFP gene selection GentleMax (Miltenyi Biotec) is the result of gene expression, Lrig1 gene expression and cell unit correlation.