敗血症における血管内皮細胞で産生されるsFlt-1の役割の解明

敗血症患者では、血管内皮増殖因子VEGFの可溶型受容体であるsFlt-1の血中濃度が重症化に伴い上昇しているが、敗血症の進展と重症化におけるsFlt-1の役割は明らかになっていない。sFlt-1の主要産生臓器である血管内皮細胞特異的にsFlt-1をノックダウンするマウスを作成し、敗血症モデルによりsFlt-1の役割を解明する。敗血症におけるsFlt-1の役割を直接解析するために、血管内皮細胞特異的、かつ時期特異的にsFlt-1をノックダウンできるシステムを構築した。テトラサイクリン依存的にmiRNAを発現するために、Fellmannら（Cell Rep. 2013）が構築したシステムを参考に発現ベクターを作製した。このベクターでは、テトラサイクリン依存的にGFPが発現し、その3'UTRにあるmiRNAが機能する。マウスsFlt-1安定発現Tet-on細胞にレンチウイルスによりmiRNAを発現させ、GFP発現細胞をソーティングにより選択した後、マウスsFlt-1 mRNAをqPCRにより解析した。２種類のmiRNA配列で、いずれも３割り程度まで発現が抑制されていることが確認された。タンパク質レベルを確認後、トランスジェニックマウス作成に進む予定である。sFlt-1の産生を制御するタンパク質の同定を行った。sFlt-1産生制御配列付近のRNA配列をプローブにして、結合するタンパク質を質量分析により解析したところ、３種類のRNA結合タンパク質が候補として同定された。それぞれの遺伝子をクローニングし、初代培養ヒト微小血管内皮細胞に過剰発現させたところ、タンパク質XがsFlt-1の発現を抑制したことから、タンパク質XがsFlt-1産生制御因子の可能性が示唆された。

敗血症患者では、血管内皮増殖因子VEGFの可溶型受容体であるsFlt-1の血中濃度が重症化に伴い上昇しているが、敗血症の進展と重症化におけるsFlt-1の役割は明らかになっていない。sFlt-1の主要産生臓器である血管内皮細胞特異的にsFlt-1をノックダウンするマウスを作成し、敗血症モデルによりsFlt-1の役割を解明する。敗血症におけるsFlt-1の役割を直接解析するために、血管内皮細胞特異的、かつ時期特異的にsFlt-1をノックダウンできるシステムを構築した。テトラサイクリン依存的にmiRNAを発現するために、Fellmannら（Cell Rep. 2013）が構築したシステムを参考に発現ベクターを作製した。このベクターでは、テトラサイクリン依存的にGFPが発現し、その3'UTRにあるmiRNAが機能する。マウスsFlt-1安定発現Tet-on細胞にレンチウイルスによりmiRNAを発現させ、GFP発現細胞をソーティングにより選択した後、マウスsFlt-1 mRNAをqPCRにより解析した。２種類のmiRNA配列で、いずれも３割り程度まで発現が抑制されていることが確認された。タンパク質レベルを確認後、トランスジェニックマウス作成に進む予定である。sFlt-1の産生を制御するタンパク質の同定を行った。sFlt-1産生制御配列付近のRNA配列をプローブにして、結合するタンパク質を質量分析により解析したところ、３種類のRNA結合タンパク質が候補として同定された。それぞれの遺伝子をクローニングし、初代培養ヒト微小血管内皮細胞に過剰発現させたところ、タンパク質XがsFlt-1の発現を抑制したことから、タンパク質XがsFlt-1産生制御因子の可能性が示唆された。